常雪薇 ，薛滿滿，李春明，楊立學(xué)*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱 150040; 3.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150080)

0 引言

美國白蠟(Fraxinusamericana)為木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus)落葉喬木，原產(chǎn)于加拿大南部和美國，最早于20世紀(jì)60年代引入我國，在華北地區(qū)廣泛分布[1-3]。美國白蠟具有耐旱、耐寒、耐澇和耐鹽堿等優(yōu)良特性，是鹽堿地造林、公路綠化、城市街道綠化的重要樹種[4]。其種子繁殖成活率較高，但是由于美國白蠟的幼齡期長，具有明顯的結(jié)實(shí)間隔性，且種子具有深度休眠的特性，進(jìn)行播種時(shí)要先打破休眠[5]。在無性繁殖中，扦插繁殖具有操作簡單、成本較低、材料充足和繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳方面可以保持母樹優(yōu)良的品質(zhì)，有利于優(yōu)良個(gè)體的擴(kuò)繁[6]。目前對(duì)美國白蠟扦插繁殖報(bào)道較少，且主要對(duì)扦插技術(shù)方面進(jìn)行了研究，其扦插生根過程中的一系列生理變化及生根類型尚不明確。本試驗(yàn)通過對(duì)美國白蠟扦插過程中的內(nèi)源激素含量和酶活性進(jìn)行分析，為美國白蠟的生根機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

試驗(yàn)于2020年8月在黑龍江省牡丹江市陽明區(qū)茂森苗木種植專業(yè)合作社溫室中進(jìn)行(44°6′N，129°63′E)，該地處于中溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年均降水量約540 mm，年均氣溫4.3 ℃。試驗(yàn)期間棚內(nèi)溫度保持在20～30 ℃，空氣相對(duì)濕度維持在90%以上。

1.2 試驗(yàn)材料的選取及處理

從苗圃選擇生長健壯的2年生優(yōu)良母株，選取無病蟲害、粗細(xì)大致相同的當(dāng)年生枝條剪成長5～8 cm的插穗，每枝插穗留2～3個(gè)芽，1片葉，上端平剪，下端45°左右斜剪，切口距芽約1 cm，上切口用封口膠密封。選用草炭土與蛭石的體積為1∶3作為基質(zhì)，插穗采用北京博奧拓達(dá)科技有限公司生產(chǎn)的外源激素萘乙酸(NAA)(150 mg/L)處理6 h，清水處理為對(duì)照，重復(fù)3次，每次重復(fù)100根。

分別在插后0、6、12、18、24、30 d取樣，共取6次，每次重復(fù)選取5根插穗用清水沖洗干凈，對(duì)插穗生根狀況拍照記錄后取基部2 cm左右韌皮部剪碎稱重后裝入凍存管，迅速放入液氮罐中保存，待取樣完成后干冰冷凍下寄回實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

內(nèi)源激素的測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，稱取0.3 g樣品加液氮研磨成粉末狀，對(duì)插穗內(nèi)生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA3)含量進(jìn)行測(cè)定。

酶活性測(cè)定：多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)和過氧化物酶(POD)酶活性選用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒，按照說明書的步驟進(jìn)行測(cè)定。

用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并做表，用SigmaPlot12.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國白蠟生根過程中形態(tài)學(xué)研究

經(jīng)觀測(cè)，美國白蠟主要為皮部生根型，少量為混合生根型。扦插前6 d，插穗葉片鮮活無明顯變化，插穗基部皮孔變大；第12 天觀察到插穗下切口開始膨大，插穗的皮下有白色愈傷組織生成，且部分插穗皮部凸起，形成白色顆粒；第18天觀察發(fā)現(xiàn)插穗從皮部開始生成不定根，少量在愈傷組織部位處生根；第24天，插穗不定根大量產(chǎn)生并開始伸長，且開始出現(xiàn)側(cè)根。扦插后第30天，插穗不定根持續(xù)伸長，且側(cè)根逐漸增多變粗，插穗生根數(shù)和形態(tài)基本保持穩(wěn)定。故其生根進(jìn)程可大致分為3個(gè)時(shí)期：0～12 d為生根誘導(dǎo)期(愈傷組織形成)，12～24 d為不定根表達(dá)期(不定根出現(xiàn))，24 d后為不定根伸長發(fā)育期，如圖1所示。

圖1 美國白蠟扦插生根過程中段插穗形態(tài)

2.2 美國白蠟生根過程中內(nèi)源激素含量及比值變化

2.2.1 IAA含量變化

美國白蠟生根過程中，NAA處理組與CK對(duì)照組內(nèi)源激素IAA含量變化趨勢(shì)大致相同，均呈上升—下降趨勢(shì)。扦插0～6 d，處理組和對(duì)照組插穗內(nèi)源激素IAA含量均上升，并在第6天到達(dá)峰值，此時(shí)處理組比對(duì)照組的同期值高14.08%。扦插12～18 d，處理組IAA含量小幅度地升高。扦插18～30 d，隨著不定根的表達(dá)和伸長，IAA含量又開始降低。CK對(duì)照組插穗6 d后內(nèi)源激素IAA含量下降，在12～24 d趨于平緩。插穗生根誘導(dǎo)期處理組IAA含量大于對(duì)照組，說明外源施加NAA可以增加插穗內(nèi)源激素IAA含量。如圖2所示。

圖2 美國白蠟扦插生根過程中IAA含量變化

2.2.2 ABA含量變化

處理組插穗基部ABA含量呈上升—下降—上升—下降趨勢(shì)，對(duì)照組呈上升—下降—上升趨勢(shì)。扦插0～6 d，處理組和對(duì)照組的ABA含量均顯著升高。6～12 d，處理組和對(duì)照組ABA含量開始下降，此時(shí)愈傷組織形成、根原基出現(xiàn)。12～24 d，隨著不定根的出現(xiàn)和伸長，處理組ABA含量開始迅速上升，并于第24天達(dá)到峰值，為67.71 ng/g，同期值比對(duì)照組高出83.70%，此時(shí)根源基開始發(fā)育、不定根逐漸形成，而對(duì)照組缺少激素刺激發(fā)育較慢，ABA含量仍呈下降趨勢(shì)。24 d之后插穗進(jìn)入到不定根伸長期，處理組ABA含量又開始降低，此時(shí)對(duì)照組ABA含量開始升高，比處理組落后12 d如圖3所示。

圖3 美國白蠟扦插生根過程中ABA含量變化

2.2.3 GA3含量變化

處理組GA3含量變化趨勢(shì)呈上升—下降、對(duì)照組呈上升—下降—上升—下降。扦插后0～6 d，2組GA3含量均呈上升趨勢(shì)，6～12 d開始逐漸降低，12～24 d處理組含量持續(xù)降低，對(duì)照組含量呈升高趨勢(shì)，且在第24天達(dá)到峰值，為9.72 ng/g，比處理組同期值高19.08%。24 d之后插穗進(jìn)入不定根伸長發(fā)育期，處理組GA3含量開始小幅度升高，對(duì)照組GA3含量開始下降，在第30天逐漸和處理組的值趨于一致。如圖4所示。

圖4 美國白蠟扦插生根過程中GA3含量變化

2.2.4 ZR含量變化

NAA處理組和對(duì)照組插穗的ZR含量變化趨勢(shì)基本一致，均為下降—上升，如圖5所示。處理組前6 d ZR含量下降，而后ZR含量一直升高，且前期上升較慢，后期上升較快；對(duì)照組扦插后ZR含量降低，且谷值低于處理組，比處理組降低8.85%，6～12 d迅速升高，24 d之后對(duì)照組有下降的趨勢(shì)。0～12 d，插穗的ZR含量先下降后上升，插穗剛脫離母體ZR含量降低，隨后進(jìn)入插穗生根誘導(dǎo)期，且有愈傷組本織的生成，ZR含量升高。12～18 d，插穗開始產(chǎn)生不定根，此時(shí)ZR含量一直升高，18～24 d 內(nèi)源激素ZR含量上升較快。24 d后，處理組ZR含量緩慢上升，對(duì)照組下降。

圖5 美國白蠟扦插生根過程中ZR含量變化

2.2.5 IAA/ABA值的變化

本研究中發(fā)現(xiàn)：處理組IAA/ABA值變化明顯，扦插0～12 d處理組的IAA/ABA值下降之后又有所升高，并保持在較高值，此時(shí)為生根誘導(dǎo)階段，說明根原基的誘導(dǎo)需要較高的IAA/ABA值。12～24 d，處理組比值開始降低，此時(shí)為不定根表達(dá)期，在此階段ABA含量不斷增加，而IAA被消耗，IAA/ABA值下降，于24 d達(dá)到谷值0.54，比對(duì)照組的同期值低44.33%，這與對(duì)照組在12 d之后的變化趨勢(shì)相反。24 d后，隨著插穗不定根的伸長，處理組的IAA/ABA值又開始升高。對(duì)照組插穗IAA/ABA值變化平緩，0～12 d比值呈下降趨勢(shì)，之后12～30 d緩慢升高，且比值一直大于處理組。如圖6所示。

圖6 美國白蠟扦插生根過程中IAA/ABA值變化

2.2.6 IAA/ZR值的變化

在插穗生根進(jìn)程中，處理組IAA/ZR值呈上升—下降趨勢(shì)，對(duì)照組IAA/ZR值呈上升—下降—上升的趨勢(shì)。扦插前 6 d，處理組和對(duì)照組的IAA/ZR值均升高，并在第6 天達(dá)到峰值，處理組比對(duì)照組的同期值高4.51%。6～12 d，2組的IAA/ZR值降低，但仍大于初始值。12～18 d，處理組和對(duì)照組IAA/ZR值都處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且2組都保持在較高水平，說明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表達(dá)。18～24 d，2組比值均呈下降趨勢(shì)，處理組下降速度較快。24 d后處理組IAA/ZR值持續(xù)下降，對(duì)照組升高。說明高比值的IAA/ZR有助于插穗不定根的表達(dá)，如圖7所示。

圖7 美國白蠟扦插生根過程中IAA/ZR值變化

該試驗(yàn)觀察并分析美國白蠟在生根進(jìn)程中30 d的變化，分別在插后0、6、12、18、24、30 d取樣，得出外源激素NAA處理對(duì)美國白蠟生根進(jìn)程中插穗內(nèi)源激素含量及其比值的特征值影響，見表1。

表1 NAA處理對(duì)生根進(jìn)程中插穗內(nèi)源激素含量及其比值的特征值影響

2.3 美國白蠟生根過程中相關(guān)酶活性的變化

2.3.1 POD活性的變化

處理組和對(duì)照組POD活性變化趨勢(shì)基本一致，均呈現(xiàn)上升—下降—上升的變化趨勢(shì)。0～12 d，處理組和對(duì)照組POD活性升高，在第12天達(dá)到最高水平，處理組比對(duì)照組峰值低5.57%。之后POD活性開始降低，在扦插24 d之后，又開始升高，24 d之后插穗進(jìn)入不定根伸長期，POD活性升高，如圖8(a)所示。

2.3.2 PPO活性的變化

NAA處理組和對(duì)照組PPO活性變化趨勢(shì)大致相同，都呈上升—下降趨勢(shì)，但出現(xiàn)峰值的時(shí)間不同。扦插前期，對(duì)照組和處理組酶活性均增加。處理組在12 d達(dá)到峰值比對(duì)照組同期值高96.97%，既在愈傷組織形成期和不定根發(fā)生過渡期PPO活性達(dá)到最高。扦插后12～24 d，處理組PPO活性逐漸降低，并在第24天達(dá)到最小值。24 d后插穗體內(nèi)PPO活性逐漸回升。如圖8(b)所示。

圖8 美國白蠟插穗生根過程中氧化酶活性變化

2.3.3 IAAO活性的變化

NAA處理組的IAAO活性變化趨勢(shì)呈上升—下降—上升，對(duì)照組呈升高—下降—升高—下降。扦插初期，處理組和對(duì)照組IAAO活性均升高，NAA處理組峰值比對(duì)照組高16.16%；扦插6～18 d，處理組IAAO活性降低，且在第18天降低至最小值；扦插18～30 d，NAA處理組的IAAO活性開始升高，IAAO活性的升高導(dǎo)致同期IAA含量的下降。對(duì)照組插穗在扦插12 d之后IAAO活性就開始升高，比處理組提前6 d；對(duì)照組在24 d之后IAAO活性開始降低，與處理組趨勢(shì)相反，如圖8(c)所示。

通過對(duì)美國白蠟生根過程0～30 d 的觀察，得到外源激素NAA處理對(duì)生根進(jìn)程中插穗氧化酶活性的特征值的影響，見表2。

表2 NAA處理對(duì)生根進(jìn)程中插穗氧化酶活性的特征值影響

2.4 各生理指標(biāo)間相關(guān)性分析

由表3相關(guān)性分析結(jié)果表明，在生根過程中IAA含量與ABA、GA3含量和PPO酶活性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；ABA與GA3含量及PPO活性之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；GA3含量與PPO活性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與IAAO活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；POD與PPO活性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表3 插穗不同生長階段生理指標(biāo)相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

美國白蠟插穗生根過程根據(jù)其外部形態(tài)變化可分為3個(gè)階段：0～12 d為生根誘導(dǎo)階段；12～24 d為不定根表達(dá)階段；24 d后為不定根伸長階段。較高含量的IAA和ZR有利于插穗根原基的產(chǎn)生。較低含量的IAA、ABA和較高含量的GA3、ZR有利于插穗不定根的伸長。較高的IAA/ABA和IAA/ZR值有利于根原基的發(fā)生，不定根的發(fā)生和伸長需要較低的IAA/ZR值。外源激素的使用在一定程度上影響著酶活性的變化。高活性的POD和PPO有助于根源基的形成和不定根的分化，低活性的IAAO有助于根原基的形成和不定根的表達(dá)，高活性的IAAO有利于不定根的伸長。

3.2 討論

生長素的動(dòng)態(tài)變化是研究植物扦插內(nèi)源激素的重點(diǎn)，普遍認(rèn)為IAA能夠有效促進(jìn)不定根的發(fā)生和伸長。在扦插過程中，插穗不定根的生成受到多種因素影響，其中生長素對(duì)插穗生根具有明顯的促進(jìn)作用[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，IAA對(duì)插穗生根具有直接影響，生根誘導(dǎo)和不定根表達(dá)都需要較高水平的IAA，這與史鋒厚等[9]對(duì)南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)的研究結(jié)果一致；在不定根表達(dá)期，處理組的IAAO活性降低到谷值，使得被IAAO氧化分解的IAA減少，因此處理組IAA含量上升并達(dá)到峰值，這與胡國宇等[10]對(duì)費(fèi)約果(Feijoasellowiana)扦插的研究結(jié)果一致。

ABA通常被認(rèn)為是生根抑制劑，插穗內(nèi)ABA含量越高，插穗生根越困難[11]，其主要生理功能為抑制細(xì)胞分裂，促進(jìn)葉片脫落。一般認(rèn)為ABA對(duì)逆境激素的調(diào)節(jié)作用明顯，所以研究插穗體內(nèi)的ABA含量的變化有著重要的意義。ABA在逆境條件下可以引起植物氣孔關(guān)閉，提高植物抗逆性，本研究中扦插初期插穗ABA含量升高，可增強(qiáng)離體插穗對(duì)逆境的適應(yīng)性，降低逆境對(duì)切口損傷的影響，并對(duì)根原基的產(chǎn)生做準(zhǔn)備，這與朱晗等[12]對(duì)沙生檉柳(Tamarixtaklamakanensis)的研究結(jié)果一致。之后在不定根發(fā)生階段ABA含量持續(xù)增加，在不定根伸長階段ABA含量又開始降低，這與楊宏偉等[13]對(duì)黑枸杞(Lyciumruthenicum)的研究結(jié)果一致。多數(shù)情況下植物生長發(fā)育過程受多種激素的調(diào)節(jié)，植物不定根的形成也是多種植物激素共同影響的結(jié)果，因此在激素含量變化中研究兩兩比值可以更全面地評(píng)述多種激素對(duì)扦插不定根發(fā)育的影響[14]。ABA與IAA含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，ABA通過與IAA 的平衡來調(diào)控插穗的生根，較高的IAA/ABA值可促進(jìn)插穗生根[17]。外源激素的使用雖然沒有使插穗體內(nèi)ABA含量降低，但是卻調(diào)節(jié)了IAA/ABA的比值，對(duì)插穗體內(nèi)內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)平衡起到了調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)插穗生根；在不定根伸長期，較低的IAA/ABA值有利于美國白蠟不定根的伸長發(fā)育。

GA3是細(xì)胞分裂的促進(jìn)物質(zhì)，能促進(jìn)植株莖的伸長，普遍認(rèn)為高含量的GA3阻礙根原基形成[15-16]。在本次研究中，GA3含量在扦插初期有所升高，處理組含量在根原基誘導(dǎo)和不定根伸長發(fā)育階段持續(xù)降低，低含量的GA3有助于根源基的產(chǎn)生與不定根的伸長，這與韓繼紅等[17]的研究結(jié)果一致。在不定根表達(dá)期，處理組的GA3含量降低，對(duì)照組的GA3含量升高，這可能是由于外源激素的使用抑制了GA3的產(chǎn)生，導(dǎo)致處理組和對(duì)照組變化趨勢(shì)相反。IAA與ABA、GA3含量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，三者之間相互影響共同調(diào)控美國白蠟的生根過程。

ZR是一種主要的天然游離型細(xì)胞分裂素，有研究認(rèn)為ZR抑制不定根的形成[18]。ZR含量先降低后持續(xù)升高，外源激素的使用降低了不定根形成期插穗的ZR含量，說明根源基誘導(dǎo)不定根形成要求低含量的ZR。IAA/ZR值在愈傷組織形成初期升高，NAA處理提高了插穗的IAA/ZR值，且較高的IAA/ZR值有助于根原基的生成，這與胡國宇等[10]對(duì)費(fèi)約果的研究結(jié)果一致。不定根表達(dá)前期，處理組和對(duì)照組IAA/ZR值都處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且2組都保持在較高水平，說明當(dāng)IAA/ZR值較高且相對(duì)穩(wěn)定時(shí)有利于根源基的發(fā)育。不定根表達(dá)后期由于不定根大量生出且開始伸長，消耗大量 IAA，同時(shí)插穗自身可能合成內(nèi)源ZR，ZR相對(duì)含量升高，使得IAA/ZR值逐漸下降，較低的IAA/ZR值有利于不定根的伸長。

在插穗生長和生根過程中，酶具有重要作用。目前對(duì)酶活性的研究主要集中在IAAO、POD、PPO與扦插生根的關(guān)系[19-20]。POD是一種活性較高的酶[21]，其活性在許多植物的扦插中被用于界定生根階段(根源基誘導(dǎo)期、不定根表達(dá)期)。本研究扦插前期POD活性增高，此時(shí)為愈傷組織形成和不定根出現(xiàn)的過渡時(shí)期，說明POD酶活性的增高可促進(jìn)美國白蠟愈傷組織的形成和不定根的分化。在伸長期之前，2組的POD活性呈單峰變化趨勢(shì)，在不定根伸長期POD活性有所回升，在整個(gè)生根過程中處理組與對(duì)照組之間的POD活性差異不顯著，說明NAA的使用對(duì)美國白蠟插穗韌皮部的POD活性影響不大。

通過油橄欖(Oleaeuropaea)[22]扦插發(fā)現(xiàn)，生根率較低的插穗PPO活性較低，而生根率較高插穗PPO活性較高，韃靼忍冬(Loniceratatarica)[23]的扦插中PPO活性峰值大多出現(xiàn)在不定根表達(dá)、生根和伸長階段，高PPO活性有利于插穗生根。本研究結(jié)果表明PPO活性在根源基發(fā)育期達(dá)最高水平，說明較高的PPO活性有利于根原基的誘導(dǎo)與根系的發(fā)育。PPO活性與IAA含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，可能是由于PPO可以催化酚類物質(zhì)與IAA合成“IAA-酚酸復(fù)合物”，通過調(diào)節(jié)IAA的代謝，促進(jìn)愈傷組織和不定根的產(chǎn)生[24]。在不定根表達(dá)期酚類物質(zhì)分解，插穗不再需要大量的PPO，因此PPO活性降低。隨著處理組根系進(jìn)入伸長期，插穗發(fā)育成完整的個(gè)體，PPO活性增加。NAA的使用提高了處理組PPO活性，這與黃梅等[25]的研究結(jié)果一致。PPO與POD活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，生根過程中兩者的變化趨勢(shì)相似，而在對(duì)美國薄荷(Monardadidyma)[26]的研究中，PPO與POD活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這2種酶之間的相互作用還需進(jìn)一步研究。

IAAO是植物體內(nèi)廣泛存在的一種酶，可以通過對(duì)插穗內(nèi)的IAA含量調(diào)控來實(shí)現(xiàn)對(duì)插穗生長的影響。本研究中，在不定根表達(dá)期插穗體內(nèi)IAAO活性降至最低，從而使IAA含量升高促進(jìn)生根，這與鄭巧巧等[27]的試驗(yàn)結(jié)果一致。美國白蠟插穗生根與IAAO、POD、PPO活性緊密聯(lián)系，但在不同的生長階段IAAO、POD、PPO活性之間是否存在聯(lián)系尚不明確。

本研究記錄了美國白蠟插穗的生根過程和生根類型，劃分了生根階段，對(duì)生根過程中4種內(nèi)源激素含量與3種氧化酶活性進(jìn)行了研究，對(duì)美國白蠟的生根機(jī)理進(jìn)行了初步探究。但林木扦插生根是一個(gè)復(fù)雜的過程，美國白蠟生根過程中的礦質(zhì)養(yǎng)分(鋅、錳和鐵等)含量以及酚類化合物含量對(duì)插穗生根的影響有待進(jìn)一步研究。