胡昀昀，應(yīng)翩，楊華娣，張瑜芯，姚志韜

（1.浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310006）

宮腔機(jī)械性損傷所致的宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷后繼發(fā)肌壁間粘連，導(dǎo)致宮頸管、子宮部分或全部閉塞，引起月經(jīng)異常、腹痛、不孕等癥狀的疾病[1]。據(jù)報(bào)道，25%～30%[1]女性在多次人工流產(chǎn)、刮宮后均可出現(xiàn)宮腔粘連，其中僅22.5%～33.3%[2]可出現(xiàn)再次妊娠，嚴(yán)重影響女性的生殖健康。減味二藤湯是本課題組在國家級(jí)名老中醫(yī)裘笑梅經(jīng)驗(yàn)方二藤湯的基礎(chǔ)上化裁而成，對(duì)腎虛為本、瘀熱互結(jié)引起的盆腔感染、月經(jīng)異常有確切療效[3]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，減味二藤湯能減輕中重度宮腔粘連分離術(shù)后患者的月經(jīng)情況及妊娠結(jié)局[4-5]，但該方的具體作用機(jī)制尚不明確。子宮內(nèi)膜纖維化是宮腔粘連的主要病理學(xué)特征，是其本質(zhì)[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)脂質(zhì)累積出現(xiàn)脂毒性，可導(dǎo)致各類重要器官纖維化，如肝纖維化、腎纖維化等[8-9]，其中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）調(diào)控的脂肪酸氧化（FAO）是細(xì)胞纖維化的關(guān)鍵途徑[10-11]。那么，減味二藤湯是否可以通過激活PPAR-α/FAO信號(hào)通路、誘導(dǎo)脂肪酸氧化來達(dá)到抑制宮腔機(jī)械性損傷大鼠的子宮內(nèi)膜纖維化進(jìn)程？基于此，本課題組擬通過觀察減味二藤湯對(duì)宮腔機(jī)械性損傷大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）中PPAR-α/FAO相關(guān)蛋白的影響，探討其可能的干預(yù)機(jī)制，以期為中醫(yī)證治宮腔機(jī)械性損傷導(dǎo)致的宮腔粘連纖維化提供新的依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)8周齡雌性SD大鼠，8周齡雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，各10只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫控制在22～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲食、飲水，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。

1.2 試劑與儀器PPAR-α抑制劑GW6471（美國Sigma公司）；DMEM/F12培養(yǎng)液及胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8，碧云天生物技術(shù)有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體、I型膠原蛋白（Collagen I）抗體、纖連蛋白（Fibronectin）抗體、PPAR-α抗體、?；o酶A氧化酶1（ACOX1）抗體、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）抗體（美國Abcam公司）；GAPDH抗體（杭州賢至生物有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠親和免疫球蛋白（IgG）（H+L）二抗、HRP標(biāo)記山羊親和抗兔IgG（H+L）二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。IX51倒置熒光顯微鏡（美國Leica公司）；SW-CJ-1FD無菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電泳儀、垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.3 藥物及制備減味二藤湯由紅藤20 g、忍冬藤20 g、威靈仙15 g、菟絲子10 g、牡丹皮5 g組成，以上中藥飲片購自浙江省中醫(yī)院中藥房。取藥材按8倍比例加水，浸泡20 min，文火煎煮40 min，用紗布濾凈再加8倍水，文火煎煮30 min，紗布過濾，合并濾液，濃縮定容至100 mL，其原液質(zhì)量濃度為0.7 g/mL。放入玻璃瓶中，密封，標(biāo)記，冷藏。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組采用機(jī)械性損傷法建立宮腔粘連大鼠模型[12]。將10只性成熟未交配的雌性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。于每日8∶00、16∶00行陰道涂片，顯微鏡下觀察陰道上皮細(xì)胞的形態(tài)，確定大鼠動(dòng)情周期。取動(dòng)情期SD大鼠建模，隨機(jī)選擇5只大鼠（右側(cè)子宮）作為模型組，另5只大鼠作為正常組。方法：術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，將大鼠仰臥位固定在手術(shù)板上，碘伏消毒，于下腹部正中做一長(zhǎng)為2～3 cm的縱行切口，進(jìn)入腹腔，暴露“V”形子宮。于右側(cè)子宮中上1/3處剪開一直徑2 mm縱切口，使用直徑2 mm刮匙上下刮取子宮內(nèi)膜組織。刮宮時(shí)可用指腹捏住子宮，感知刮宮程度，防止刮穿子宮肌層，子宮壁菲薄半透明時(shí)停止刮宮，采用可吸收線縫合切口，逐層關(guān)腹。術(shù)后肌肉注射青霉素鈉200 U·g-1，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。術(shù)后每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、排便及體質(zhì)量情況。于造模后14 d取樣分離細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)正常大鼠ESCs來源于正常組8周齡正常動(dòng)情期雌性SD大鼠的子宮內(nèi)膜組織，纖維化ESCs來源于模型組刮宮之后的雌性SD大鼠子宮內(nèi)膜組織。收集的子宮內(nèi)膜組織，采用預(yù)冷的HBSS清洗3次后，剔除血塊及黏液，將子宮內(nèi)膜組織剪成0.5～1 mm3大小的碎塊，離心去除上清液，向組織沉淀中加入0.8 mg·mL-1的Ⅰ型膠原酶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化約60 min，每15 min震蕩1次。采用DMEM/F12培養(yǎng)液+10%FBS培養(yǎng)液終止消化，移液器吹散組織塊，吸取細(xì)胞懸液，經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾，去除未完全消化的組織塊及其他雜質(zhì)成分。細(xì)胞濾液采用DMEM/F12培養(yǎng)液+10%FBS培養(yǎng)液進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。每2～3 d進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%，即可傳代。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分離的第3代ESCs，光鏡下觀察呈紡錘形，然后采用免疫熒光染色法檢測(cè)Vimentin的陽性表達(dá)情況，確定細(xì)胞純度。

1.6含藥血清制備健康8周齡Wistar雄性大鼠10只，分為空白血清組3只，含藥血清組7只。根據(jù)人與大鼠等效劑量換算法[13]計(jì)算，含藥血清組按6 g/kg減味二藤湯水煎液灌胃，空白血清組給予灌胃等體積生理鹽水，早晚10∶00各1次，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥后禁食不禁飲，最后一次給藥2 h后腹腔麻醉、取血、離心、濾膜除菌后保存于-80℃冰箱備用。

1.7 分組與給藥將細(xì)胞按照來源與給藥不同分為5組，即正常組、模型組、減味二藤湯含藥血清組（簡(jiǎn)稱含藥血清組）和空白血清組、拮抗劑組。正常組，即正常組大鼠ESCs+10%FBS；模型組，即模型大鼠ESCs+10%FBS；含藥血清組，即模型大鼠ESCs+10%含藥血清；空白血清組，即模型大鼠ESCs+10%不含藥血清；拮抗劑組，即模型大鼠ESCs+10%含藥血清+10μmol·L-1PPAR-α拮抗劑GW6471。各組給藥48 h。

1.8 CCK-8法 觀 察ESCs活 性將ESCs按 照1×104/mL接種于96孔板中，各組細(xì)胞處理完成后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃孵育4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定。另設(shè)不加細(xì)胞僅含有培養(yǎng)液的空白孔調(diào)零。每組均設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western Blot法檢測(cè)ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋 白表達(dá)各組細(xì)胞處理完成后，裂解提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白水浴煮沸5 min使其變性，自然冷卻后-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)SDS-PAGE泳道分別加入50μg蛋白質(zhì)，電泳時(shí)間約為2 h后將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫低速搖床封閉2 h。0.1%TBST清洗封閉后的條帶膜，根據(jù)各目的蛋白質(zhì)分子量切膜，各指標(biāo)分別用相應(yīng)的一抗（GAPDH以1∶1 000稀釋，PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ及Fibronectin以1∶1 500稀釋）孵育，4℃過夜。次日，TBST充分洗滌PVDF膜，分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，1∶5 000稀釋；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋），37℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。利用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯色，最后，使用ImageJ軟件（National Institutes of Health，美國）進(jìn)行分析，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布且方差齊性，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ESCs的鑒定圖1結(jié)果顯示，宮腔機(jī)械性損傷大鼠體外培養(yǎng)的ESCs和正常大鼠體外培養(yǎng)的ESCs波形蛋白（Vimentin）表達(dá)陽性，而模型大鼠ESCs表達(dá)量較正常大鼠ESCs增多，提示模型大鼠存在ESCs纖維化。

圖1 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ESCs中波形蛋白（Vimentin）表達(dá)結(jié)果（×200）Figure 1 Results of Vimentin expression in ESCs detected by cellular immunofluorescence（×200）

2.2 各組ESCs活力比較圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的ESCs活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，空白血清組的ESCs活性無明顯差異（P＞0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組ESCs活性降低（P＜0.01）；與含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs活性升高（P＜0.05）。表明減味二藤湯對(duì)ESCs活性具有明顯的抑制作用，而PPAR-α拮抗劑GW6471處理可明顯拮抗減味二藤湯的抑制作用，使ESCs活性增強(qiáng)，這提示減味二藤湯可通過激活PPAR-α抑制ESCs活性。

圖2 各組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）活力比較Figure 2 Comparison of the viability of ESCs among various groups

2.3 各組大鼠ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)比較

圖3、表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；模型組各指標(biāo)與空白血清組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。表明PPAR-α拮抗劑GW6471能有效阻斷減味二藤湯對(duì)ESCs的抑制作用，進(jìn)一步表明減味二藤湯可以有效降低子宮內(nèi)膜機(jī)械性損傷大鼠ESCs的纖維化蛋白表達(dá)，其作用途徑可能是通過激活PPAR-α完成的。

圖3 各組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、?；o酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）蛋白電泳圖Figure 3 Protein electrophoresis of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），CollagenⅠ，F(xiàn)ibronectin in each group

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、酰基輔酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）相對(duì)蛋白表達(dá)量比較Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）、?；o酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fibronectin）相對(duì)蛋白表達(dá)量比較Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與空白血清組比較；④P＜0.05，與含藥血清組比較

組別正常組模型組空白血清組含藥血清組拮抗劑組α-SMA/GAPDH 0.196±0.009 0.812±0.083①0.772±0.060①0.481±0.033①②③0.686±0.040①③④CollagenⅠ/GAPDH 0.331±0.028 0.794±0.046①0.768±0.044①0.501±0.021①②③0.642±0.033①②③④Fibronectin/GAPDH 0.380±0.054 0.899±0.066①0.863±0.097①0.573±0.067①②③0.905±0.062①③④PPAR-α/GAPDH 0.922±0.053 0.490±0.037①0.485±0.023①0.720±0.048①②③0.535±0.029①③④ACOX1/GAPDH 0.896±0.065 0.398±0.055①0.324±0.018①0.854±0.029②③0.383±0.026①③④CPT1A/GAPDH 0.845±0.077 0.229±0.014①0.211±0.006①0.642±0.017①②③0.388±0.033①②③④

3 討論

目前宮腔機(jī)械性損傷引起的宮腔粘連發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其本質(zhì)為子宮內(nèi)膜纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，組織纖維化與胞內(nèi)脂質(zhì)的累積出現(xiàn)脂質(zhì)毒性相關(guān)[5，14-16]。那么，如何有效促進(jìn)ESCs的脂肪酸氧化，改善局部纖維化是目前值得深入研究的問題。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α/FAO通路對(duì)維持脂質(zhì)代謝的平衡起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。激活PPAR-α可促進(jìn)FAO進(jìn)程，使細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，由溶酶體進(jìn)行降解，并減少脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）和甘油三酯（triglyceride，TG）的合成，從而減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[17]。FAO限速步驟之一是FA進(jìn)入線粒體，此過程由?；o酶A氧化酶（Acyl-Co A Oxidase，ACOX）依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)控制，其中涉及的肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶I（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）是PPAR-α的直接靶基因[18]。

中醫(yī)學(xué)并無宮腔粘連的病名，可將其歸屬于“月經(jīng)過少”“不孕”“痛經(jīng)”等范疇，且認(rèn)為其主要是由宮腔金刃損傷胞脈、脈絡(luò)瘀阻，致腎中精氣受損，沖任氣血不足，胞脈閉塞所致。葉天士云：“大凡絡(luò)虛，通補(bǔ)最宜。”故以活血通絡(luò)為主導(dǎo)，少佐補(bǔ)腎通經(jīng)之品，通補(bǔ)兼施，可達(dá)治療IUA的目的[19]。減味二藤湯是由國家級(jí)名老中醫(yī)裘笑梅經(jīng)驗(yàn)方二藤湯篩選化裁而來，方中：君藥紅藤、忍冬藤可清熱通絡(luò)，臣藥威靈仙散結(jié)通絡(luò)，佐藥菟絲子可平調(diào)腎中陰陽，使藥牡丹皮涼血活絡(luò)，諸藥合用可清熱涼血、通經(jīng)活絡(luò)，共奏調(diào)控腎-天癸-沖任-胞宮軸之效，從而達(dá)到補(bǔ)腎通絡(luò)調(diào)經(jīng)的目的。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平升高，PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達(dá)水平下降，提示宮腔機(jī)械性損傷大鼠ESCs中PPAR-α/FAO通路受抑制，而與模型組/空白血清組比較，減味二藤湯含藥血清組ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白 水平 降低，PPAR-α、ACOX1、CPT1升高，表明減味二藤湯可通過激活PPAR-α/FAO通路發(fā)揮改善ESCs纖維化的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，給予PPAR-α拮抗劑GW6471進(jìn)行干預(yù)，與減味二藤湯含藥血清組比較，拮抗劑組ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表達(dá)水平降低，α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin表達(dá)升高，細(xì)胞活性上升，表明GW6471可阻斷減味二藤湯對(duì)機(jī)械性損傷宮腔粘連大鼠ESCs纖維化的抑制作用，進(jìn)一步表明減味二藤湯可通過激活PPAR-α/FAO通路實(shí)現(xiàn)對(duì)ESCs纖維化的改善作用。

綜上所述，減味二藤湯可激活PPAR-α/FAO通路，抑制ESCs纖維化進(jìn)程，從而改善宮腔機(jī)械性損傷引起的宮腔粘連纖維化。