柯亞瓊，郝建波，蘆玲，陳淅泠，付艷芹

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科二病區(qū)，河南鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南鄭州 450000）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease）作為糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，是終末期腎衰竭的主要原因，早期預(yù)防糖尿病腎臟損傷十分重要[1-3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是一種已知的促纖維化細(xì)胞因子。研究表明，臨床糖尿病腎病患者血清TGF-β1水平異常增高與蛋白尿程度密切相關(guān)[4]。TGF-β1/絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)急性腎損傷和腎纖維化，抑制該通路被認(rèn)為是減輕腎臟損傷的途徑之一[5]。漢黃芩苷（wogonoside）為類黃酮單體，是中藥黃芩（為唇形科黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的根）的主要成分之一[6]，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]等藥理活性。既往有研究表明，漢黃芩苷可減輕糖尿病腎病腎組織炎癥[10]，提示漢黃芩苷對(duì)糖尿病并發(fā)腎組織損傷有治療作用。本研究擬建立糖尿病大鼠模型，進(jìn)一步探討漢黃芩苷是否可通過抑制TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗糖尿病大鼠腎損傷及纖維化的作用。又因細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5（CDK5）與胰島β細(xì)胞損傷和胰島素分泌不足有關(guān)，Roscovitine作為CDK5的抑制劑，已被證實(shí)可通過抑制TGF-β1/p38MAPK途徑發(fā)揮抗糖尿病小鼠腎纖維化的作用[11]，故以Roscovitine治療為陽性對(duì)照。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量為（180±20）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003。本研究方案已經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（批號(hào)：ZZDXDEFSYY2019009）。研究過程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義及3R原則。飼養(yǎng)環(huán)境：24℃恒溫普通飼養(yǎng)，12 h/12 h光暗交替。

1.2 藥物、試劑與儀器漢黃芩苷（分子量：460.388；分子式：C22H20O11），純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：51059-44-0。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、CDK5抑制劑Roscovitine（美國Sigma公司）；尿白蛋白（albumin，Alb）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海江萊生物技術(shù)有限公司）；α平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Ⅳ型膠原蛋白（collagenⅣ，ColⅣ）、p38MAPK、GAPDH等抗體（美國Abcam公司）；磷酸化p38絲裂原活化蛋白酶（p-p38MAPK）抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（武漢艾美捷生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、馬松（Masson）三色染色試劑、ECL Plus超敏發(fā)光液試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。iBright成像系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；全自動(dòng)生化分析儀（瑞士巴塞爾羅氏診斷公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 造模、分組與給藥將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表取10只作為正常組常規(guī)飼養(yǎng)，剩余40只給予高脂飼料喂養(yǎng)6周后用于構(gòu)建2型糖尿病模型。方法[12]：造模前禁食12 h，STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 4.0）中，每天腹腔單次注射30 mg/kg STZ（以枸櫞酸緩沖液稀釋），正常組腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。3 d后尾尖采血測定大鼠血糖，若隨機(jī)血糖濃度≥16.7 mmol/L，則判斷建模成功。繼續(xù)2周自由飲食飼養(yǎng)后，再次測量血糖證實(shí)糖尿病大鼠模型成功與否，期間無大鼠死亡。最后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組，漢黃芩苷低、高劑量組，Roscovitine對(duì)照組，每組10只。按照動(dòng)物和人用藥劑量換算關(guān)系確定大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.17倍[13]，漢黃芩苷低、高劑量組分別給予漢黃芩苷[用二甲基亞砜（DMSO）溶解]10、40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[10]，Roscovitine對(duì)照組給予Roscovitine（用DMSO溶解）40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[11]，模型組和正常組腹腔注射等體積DMSO，連續(xù)給藥時(shí)間為10周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 觀察大鼠一般狀態(tài) 包括精神狀態(tài)、毛色、飲食、排便、活動(dòng)、體質(zhì)量等。

1.4.2 標(biāo)本采集與處理 末次干預(yù)后，將大鼠放置于單獨(dú)的代謝籠里，收集尿液，以檢測24 h尿Alb含量。后禁食12 h，經(jīng)大鼠尾靜脈取血，檢測血糖值。后用戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，用于空腹血糖與腎臟功能相關(guān)指標(biāo)的測定。后處死大鼠，取出腎臟，統(tǒng)一將左腎置于4%的多聚甲醛中固定24 h用于組織學(xué)檢查，右腎保存于液氮內(nèi)用于組織蛋白質(zhì)的提取。

1.4.3 血糖和腎功能指標(biāo)檢測 取血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測定大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）。取尿液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠尿Alb水平。

1.4.4 腎組織病理學(xué)觀察 石蠟包埋的腎組織切片（4μm）經(jīng)脫蠟、水化后，根據(jù)染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行常規(guī)HE染色和Masson染色，顯微鏡觀察并照相，評(píng)估腎小球硬化和腎小管間質(zhì)病變。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn) 取液氮保存的腎臟組織，研缽碾碎后收集并加入預(yù)冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，混勻后離心，以12 000 g離心20 min，取上清。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度，統(tǒng)一濃度后進(jìn)行蛋白變性。加樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），10%SDS凝膠上分離等量的蛋白（100μg）并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，后將膜于5%脫脂乳中，37℃封閉2 h，于稀釋后的 一 抗ColⅣ、α-SMA、TGF-β1、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH（均1∶500稀釋）中4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜90 min（換液3～6次）后于25℃搖床孵育二抗（均1∶8 000稀釋）2 h，TBST洗膜90 min（換液3～6次），PVDF膜于暗處浸潤ECL顯影試劑2～3 min，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較給藥治療過程中，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食、排便無異常，活動(dòng)自如，反應(yīng)力良好，皮毛色澤自然；模型組大鼠表現(xiàn)出煩渴、多食和多尿的癥狀，消瘦，行動(dòng)遲緩，精神狀態(tài)較差，皮毛色暗、毛糙無光澤；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對(duì)照組大鼠上述癥狀均明顯好轉(zhuǎn)。表明漢黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠臨床癥狀具有一定的改善作用。

2.2 各組大鼠血糖和腎功能指標(biāo)比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組和Roscovitine對(duì)照組血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平顯著降低（P＜0.05）；漢黃芩苷低、高劑量組血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均高于Roscovitine對(duì)照組，其中，漢黃芩苷高劑量組血清FBG和SCr水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明糖尿病大鼠模型存在腎功能損害，而漢黃芩苷可改善糖尿病大鼠血糖水平及腎功能損害。

表1 各組大鼠血糖和腎功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血糖和腎功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Roscovitine對(duì)照組比較

組別正常組模型組漢黃芩苷低劑量組漢黃芩苷高劑量組Roscovitine對(duì)照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 FBG/（mmol·L-1）6.9±0.48 24.29±3.15①18.12±2.73②③9.46±1.91②8.34±1.29②166.702＜0.001 BUN/（mmol·L-1）9.37±0.65 26.24±3.87①19.75±2.06②③13.13±1.84②③11.39±1.20②133.939＜0.001 SCr/（μmol·L-1）25.15±2.63 80.65±6.78①61.26±4.12②③37.26±3.24②34.48±3.95②366.063＜0.001 Alb/（mg·L-1）5.87±0.37 26.14±3.12①19.15±2.67②③11.23±1.91②③9.17±1.12②210.420＜0.001

2.3 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠腎小球形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，腎臟無纖維組織增生及基底膜增厚，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無增殖；模型組出現(xiàn)了明顯腎間質(zhì)損傷，可見炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管管腔擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，基底細(xì)胞增生；與模型組比較，漢黃芩苷低劑量組腎組織病理損傷改善輕微，而漢黃芩苷高劑量組腎組織病理損傷得到了較大程度的改善，且與Roscovitine對(duì)照組結(jié)果相似。表明糖尿病大鼠模型存在腎組織病理損傷，而漢黃芩苷可減輕糖尿病大鼠腎組織病理損傷。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果比較（×200）Figure 1 Comparison of HE staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.4 各組大鼠腎臟組織Masson染色結(jié)果比較圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠腎組織基本正常，無膠原纖維藍(lán)色染色；模型組大鼠腎間質(zhì)和腎小球的膠原纖維藍(lán)色染色較深，蛋白沉積顯著增加，腎纖維化嚴(yán)重；漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對(duì)照組大鼠腎小球及腎間質(zhì)膠原纖維藍(lán)色染色較模型組變淺。表明糖尿病大鼠模型存在腎纖維化，而漢黃芩苷可減輕糖尿病大鼠腎纖維化。

圖2 各組大鼠腎組織Masson染色結(jié)果比較（×200）Figure 2 Comparison of Masson staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK、pp38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達(dá)比較表2、圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、高劑量組及Roscovitine對(duì)照組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；漢黃芩苷低、高劑量組腎組織TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表達(dá)水平均高于Roscovitine對(duì)照組，其中，漢黃芩苷高劑量組的α-SMA及ColⅣ蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明漢黃芩苷可抑制糖尿病大鼠腎組織纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)及TGF-β1/p38MAPK通路的活化。

表2 各組大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

表2 各組大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Roscovitine對(duì)照組比較

組別正常組模型組漢黃芩苷低劑量組漢黃芩苷高劑量組Roscovitine對(duì)照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 TGF-β1 0.18±0.02 1.15±0.11①0.96±0.10②③0.45±0.11②③0.36±0.08②285.308＜0.001 p38MAPK 0.21±0.02 1.21±0.21①0.91±0.08②③0.42±0.07②③0.35±0.06②204.559＜0.001 p-p38MAPK 0.17±0.03 1.12±0.13①0.87±0.07②③0.38±0.09②③0.32±0.06②322.456＜0.001 α-SMA 0.30±0.04 1.18±0.23①0.89±0.09②③0.39±0.10②0.37±0.08②130.284＜0.001 ColⅣ0.29±0.05 1.13±0.14①0.92±0.1②③0.38±0.07②0.37±0.08②227.323＜0.001

圖3 各組大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）的Western Blot電泳條帶圖Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups

3 討論

病理?xiàng)l件下，糖尿病的高血糖啟動(dòng)和激活一系列復(fù)雜過程，伴有大量細(xì)胞（包括間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、管狀細(xì)胞和周圍細(xì)胞）和肌母細(xì)胞活化產(chǎn)生的基質(zhì)蛋白如纖維連接蛋白、層黏連蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ膠原蛋白等，可誘導(dǎo)糖尿病腎間質(zhì)纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）[14]。TIF標(biāo)志著不可逆性腎損傷，可作為腎臟生存期的最佳預(yù)測指標(biāo)[11]，是各種腎臟疾病發(fā)展成為終末期腎衰竭的共同途徑。BUN、SCr和Alb水平是評(píng)估早期腎功能的重要指標(biāo)，白蛋白尿則是糖尿病腎臟損傷中最典型的臨床癥狀之一。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠FBG及尿Alb含量顯著升高，提示成功建立糖尿病大鼠模型并伴有腎臟損傷；而經(jīng)不同劑量漢黃芩苷及Roscovitine治療后，大鼠FBG及尿Alb含量均顯著降低，表明漢黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠腎功能。漢黃芩苷為40 mg/kg劑量時(shí)具有與Roscovitine相似的療效。

糖尿病腎臟損傷的病理標(biāo)志包括腎小球和腎小管基底膜的增厚、腎小球硬化及TIF[15]，其中，TIF為關(guān)鍵性病理過程，被認(rèn)為是導(dǎo)致腎小球和腎小管功能障礙及衰退的主要病理因素[16]，表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增多和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）尤其是大量膠原纖維如ColⅣ的過度沉積[17]。α-SMA為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)過量時(shí)，會(huì)促進(jìn)腎纖維化病理過程[18]。TGF-β1是TGF-β超家族的成員，是通過調(diào)節(jié)ECM合成參與腎臟纖維化的重要因子[19]，可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。另外，TGF-β1作為通路上游因子可激活p38MAPK信號(hào)，p-p38MAPK為p38MAPK通路 中的關(guān)鍵信號(hào)分子，其表達(dá)增強(qiáng)是該信號(hào)通路激活的標(biāo)志之一[20]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠腎臟組織發(fā)生明顯病理損傷，可見腎小球增大、炎癥細(xì)胞增多、基底膜彌漫性增厚、系膜處基質(zhì)增多，腎纖維化程度嚴(yán)重，給予漢黃芩苷干預(yù)后，大鼠腎組織纖維化得到了明顯改善，表明漢黃芩苷具有抗糖尿病腎損傷及纖維化的作用。本研究結(jié)果還顯示，模型組腎組織TGF-β1及其下游信號(hào)因子p38MAPK的磷酸化水平和腎纖維化標(biāo)志物α-SMA、ColⅣ均呈高表達(dá)，而漢黃芩苷低、高劑量組大鼠腎臟組織上述各分子指標(biāo)表達(dá)水平均較模型組降低，且高劑量漢黃芩苷的治療效果更顯著，提示漢黃芩苷可能是通過抑制TGF-β1及其下游信號(hào)因子p38MAPK的活化，進(jìn)而改善糖尿病大鼠腎纖維化。

綜上所述，漢黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠腎損傷及纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路的活化有關(guān)。