鄧 淵，賴 軍，毛夢迪，張?jiān)饺?，?淳，楊 君，王守創(chuàng)，羅 杰

（海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

椰子(Cocos nuciferaL.)是許多熱帶國家最重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。椰子屬于棕櫚科椰子屬，基因組大小約為 2.4 Gb[2-3]。根據(jù)植物形態(tài)和繁殖類型，椰子可以分為 2 種類型：typica(tall)和nana(dwarf)[4]。椰子根據(jù)進(jìn)化起源可以分為2個(gè)亞群——印度洋種群和太平洋種群[5-6]。高種椰子異花授粉，基因型表現(xiàn)為一定程度的雜合，而矮種椰子自花授粉，基因型純合。矮種椰子生長緩慢、植株矮小、樹冠較小、果小而多、椰肉厚度薄、開花時(shí)間較早，通常在種植 4～6 a 后開花，株高 10～15 m[7-9]。高種椰子耐寒，果實(shí)大，能夠適應(yīng)更廣泛的環(huán)境，株高 20～30 m，初次開花時(shí)間晚 (種植 8～10 a后開花)。在中國，椰子主要種植在海南和云南等地區(qū)，海南地區(qū)的高種椰子“Hainan Tall”有著 36 000 hm2的種植面積[10]，高種椰子耐鹽堿和高溫，但對低溫敏感。目前普遍認(rèn)為矮種椰子經(jīng)高種椰子馴化而來[4]，且矮種椰子更易受不利環(huán)境的影響。椰油占椰肉重量的65%[8,11]，與其他植物油相比,椰油具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和藥用價(jià)值。椰子油富含飽和脂肪酸(93%)，主要成分是己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕櫚酸 (C16)、硬脂酸 (C18)和花生酸 (C20)，其中85%是中鏈脂肪酸 (medium-chain fatty acids,MCFA)。據(jù)報(bào)道,月桂酸在棕櫚科中的主要來源是椰子和油棕，兩者都僅限于在熱帶和亞熱帶氣候中生長[11-14]。月桂酸能夠提高氧化穩(wěn)定性，具有低熔點(diǎn)，能產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液，這對食品和化學(xué)工業(yè)應(yīng)用具有重要意義[11]。目前月桂酸在醫(yī)藥和食品工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用，包括用于制造肥皂、洗滌劑、紡織品、油漆、清漆、化妝品、藥品等。肉豆蔻酸在食品工業(yè)中常用作調(diào)味劑和食品添加劑[15]。肉豆蔻酸有一定的藥理活性，相較于其他飽和脂肪酸，肉豆蔻酸有更強(qiáng)的抗氧化活性[16]，肉豆蔻酸還可以降低血糖[17]。除了飽和脂肪酸以外，椰子油還含有少量不飽和脂肪酸，如油酸(C18:1)、棕櫚油酸(C18:1)和亞麻酸(C18:3)。目前有報(bào)道使用椰子油可以降低阿爾茨海默病的患病風(fēng)險(xiǎn)[13-14]，抑制腫瘤生長、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，以及消除抗腫瘤藥甲氨蝶呤引起的腦神經(jīng)毒性[18-24]。植物脂肪酸代謝途徑在其他物種中已有廣泛報(bào)道[25-34]，但目前在椰子中罕有報(bào)道。不同類型椰子品種在脂肪酸積累和合成調(diào)控途徑是否存在差異，仍有待闡明。椰肉作為脂肪酸積累的主要部位，是研究脂肪酸合成調(diào)控的理想場所。本研究利用非靶向代謝組學(xué)，比較了海南高種、黃矮椰子和綠矮椰子的脂肪酸積累水平，研究表明，高種椰子的脂肪酸含量最高，黃矮椰子其次，綠矮椰子最低。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，重建了椰子脂肪酸代謝途徑，研究發(fā)現(xiàn)，相較于矮種椰子而言，脂肪酸途徑的基因大多在高種椰子中高表達(dá)。WGCNA結(jié)果表明，“Melightyellow”模塊中的基因與差異積累的脂肪酸有著相似的變化趨勢，在此基礎(chǔ)上結(jié)合模塊中結(jié)構(gòu)基因啟動子區(qū)的cis-element，預(yù)測并構(gòu)建了完整的脂肪酸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究通過組學(xué)策略探究了不同類型椰子品種脂肪酸差異的分子機(jī)理，預(yù)測并構(gòu)建了完整的椰子脂肪酸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)椰子脂肪酸合成調(diào)控的進(jìn)一步解析提供了可用資源，為高油脂椰子品種的選育提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料本試驗(yàn)材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供，包括2份高種椰子(Hainan Tall,HT)，2份黃矮椰子 (Yellow Dwarf,YD)和 2份綠矮椰子 (Green Dwarf, GD)。每份材料隨機(jī)選取3株長勢一致的植株，每株植株采摘3個(gè)大小和發(fā)育時(shí)期一致的椰果，取椰肉混合后作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并將其一分為二，一份作為轉(zhuǎn)錄樣，一份作為代謝樣。將樣品立即置于液氮冷凍，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 代謝樣品處理椰肉代謝樣品經(jīng)冷凍干燥后，采用BM500球磨儀研磨成粉末(頻率30 Hz，持續(xù)時(shí)間 1.5 min)。稱取 100 mg 研磨好的干粉樣品，加入 1.2 mL 含有 0.1 mg·L-1利多卡因內(nèi)標(biāo)的φ= 70% 甲醇提取液，渦旋 30 s，低溫靜置 10 min，重復(fù)上述操作3次后，放入4℃冰箱繼續(xù)萃取代謝產(chǎn)物 12 h，10 300 r·min-14 ℃ 離心 10 min，取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾后，放入進(jìn)樣瓶中即可用于LC-MS進(jìn)行代謝物檢測分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)處理對于原始的下機(jī)數(shù)據(jù)使用Fastp軟件的默認(rèn)參數(shù)去除低質(zhì)量序列和接頭序列，用HISAT2軟件默認(rèn)參數(shù)將其比對到矮種椰子的參考基因組，Samtools排序后使用featureCounts進(jìn)行定量，用 TPM (transcripts per million)對原始定量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。R軟件中的FactoMineR 和factoextra用于主成分分析。DEseq2用于樣本間差異表達(dá)基因的鑒定，同時(shí)滿足|log2FoldChange| ＞1 和 FDR (False Discovery Rate) ＜ 0.05 的基因被認(rèn)為是2個(gè)樣本比較間的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于非靶向代謝組學(xué)的椰子代謝譜比較為了探究不同類型椰肉的代謝組差異，選擇了6份具有代表性的椰子種質(zhì)資源，包括2份高種椰子(HT)、2份黃矮椰子(YD)、2份綠矮椰子(GD)，進(jìn)行代謝物檢測。通過 Q Exactive-Orbitrap UHPLC-ESI-MS/MS 在正離子模式下進(jìn)行非靶向掃描，共檢測到12 579種質(zhì)譜信號。為了研究椰子果肉的代謝組構(gòu)成，利用多種策略對所檢測的質(zhì)譜信號進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)解析。對于能獲取商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的代謝物，通過比對保留時(shí)間(retention time, RT)，母離子(Q1)及質(zhì)譜碎片信息等因素來鑒定代謝物。如 RT為 9.15 min的代謝信號(Cnm04191)，其母離子精確的m/z為 279.230 28，并且有149.0、219.1、57.1和105.0等一系列的特征碎片。與標(biāo)準(zhǔn)品比對，代謝信號Cnm04191由于相同的質(zhì)譜碎片信息被鑒定為α-Linolenate(圖1-A，1-B)。對于不能獲得商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的代謝物，將試驗(yàn)獲取的質(zhì)譜信息與已經(jīng)公開發(fā)表的文獻(xiàn)或者代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來初步解析代謝物結(jié)構(gòu)。RT為 8.39 min的質(zhì)譜信號 (Cnm09776)的MS1譜圖中檢測到準(zhǔn)確的m/z為518.322 20，二級質(zhì)譜碎片中觀察到[Y0]+離子184.1，這是由于形成了磷酸膽堿這一特征碎片，因此，推測質(zhì)譜信號Cnm09776 為 LysoPC (18:3/0:0) (圖1-C)。質(zhì)譜信號 Cnm06436被注釋為 Glyceryl monolinoleate(圖1-D)。通過 Compound Discoverer 3.1 軟件自動批量匹配在線代謝數(shù)據(jù)庫，包括mzCloud、ChemSpider、MassBank等進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。最終，超過 564 種代謝物被鑒定，主要為氨基酸、黃酮類化合物、有機(jī)酸、脂質(zhì) 、苯丙烷 、糖類 、多酚、生物堿、核苷酸及其衍生物、植物激素。

圖1 利用 UHPLC-HRMS 對次生代謝物進(jìn)行檢測和鑒定

基于檢測到的97種脂質(zhì)信號進(jìn)行了主成分分析 (principal component analysis, PCA)，結(jié)果表明，每個(gè)品種的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)都能較好地聚在一起，黃矮椰子和綠矮椰子聚集較近，但兩者與高種椰子相聚較遠(yuǎn)(圖2-A)。結(jié)果表明，同一樣本不同重復(fù)間的代謝數(shù)據(jù)有較高的一致性，且不同類型的椰子品種在脂質(zhì)積累水平有較大的差異，高矮種間的差異更大。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，高種椰子的脂質(zhì)水平極顯著(P＜ 2.22E-16)高于矮種椰子(圖2-C)，且綠矮椰子的脂質(zhì)積累水平最低(圖2-D)。熱圖結(jié)果表明，檢測到的97種脂質(zhì)在3種不同類型的椰子果肉中具有不同的積累模式(圖2-B)。為進(jìn)一步探究三者間脂質(zhì)積累存在差異的代謝產(chǎn)物，利用OPLS-DA對樣本兩兩間差異代謝物進(jìn)行鑒定 (YD vs HT, GD vs HT, GD vs YD)。在兩兩比較間脂質(zhì)積累存在差異的物質(zhì)共有50種，其中5種脂質(zhì)在3組比較間都表現(xiàn)為積累差異(圖2-E)。進(jìn)一步對積累存在差異的代謝物進(jìn)行注釋，脂肪酰、甘油脂、鞘脂是主要的差異物質(zhì)，其中脂肪酰占比最高達(dá)74%，鞘脂和甘油酯分別各占8% (圖2-F)。糖脂主要與光合作用及磷響應(yīng)相關(guān)[35]，鞘脂主要與植物生長、植物育性和脅迫應(yīng)答等相關(guān)[36-38]。以上結(jié)果表明，這些物質(zhì)在不同類型的椰子中迥異的積累模式，可能與它們響應(yīng)生物和非生物脅迫以及適應(yīng)不同地區(qū)的環(huán)境條件有關(guān)。

圖2 不同類型椰子品種脂質(zhì)代謝組的比較

2.2 不同類型椰子的轉(zhuǎn)錄組比較為進(jìn)一步研究不同類型椰子品種在脂質(zhì)通路的轉(zhuǎn)錄水平是否存在差異。對代表性品種的椰肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。為了解不同類型椰子的轉(zhuǎn)錄動態(tài)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA (圖3-A)。結(jié)果表明，絕大多數(shù)的生物學(xué)重復(fù)彼此聚集，表明了轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的高可靠性。此外，這些轉(zhuǎn)錄本根據(jù)樣本來源聚為3類，其中PC1捕獲了43.5%的數(shù)據(jù)方差，代表不同類型的椰子樣本之間的差異，這些結(jié)果均表明三者在基因的轉(zhuǎn)錄水平上存在較大的差異。隨后對不同類型椰子品種的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較來鑒定不同樣本間的差異表達(dá)基因(differently expressed genes, DEGs)。筆者在 HT vs YD，HT vs GD，GD vs YD 間分別鑒定到了 2 139、4 729 和 2 599 個(gè)DEGs，在兩兩比較間存在差異的基因共計(jì)5 841個(gè)，在3個(gè)比較中都存在差異表達(dá)的基因有384個(gè)(圖3-B)。為了進(jìn)一步探究差異基因的分子功能及其參與的生物學(xué)途徑，對5 841個(gè)差異基因進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)和 Gene Ontology (GO)富集分析，KEGG 結(jié)果表明這些差異基因主要與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物與病原菌互作、氨基酸代謝相關(guān)(圖3-C)。GO富集分析結(jié)果也表明，不同椰子品種的表達(dá)差異主要體現(xiàn)在赤霉素信號通路、脂質(zhì)儲存和油菜素內(nèi)酯響應(yīng)等途徑(圖3-D)。

圖3 不同品種椰子差異表達(dá)基因的鑒定與功能富集

2.3 WGCNA揭示脂肪酸合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)采用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)，將高連接度的基因定義為基因簇，同一簇內(nèi)的基因具有較高的相關(guān)性。這些表達(dá)模式相近的基因在功能上具有相關(guān)性。根據(jù)表達(dá)模式的不同可以將5 841個(gè)差異基因劃分為20個(gè)模塊，其中模塊“Melightyellow”中基因的表達(dá)模式與差異脂肪酸的積累模式高度相關(guān)(圖4-A)。隨后對“Melightyellow”中的基因進(jìn)行蛋白功能注釋和功能富集，其中參與“Fatty acid metabolism”，“Glycerolipid metabolism”，“Biosynthesis of unsaturated fatty acids”等脂肪酸相關(guān)通路的基因作為節(jié)點(diǎn)構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；诒Ｊ毓δ芙Y(jié)構(gòu)域、蛋白功能注釋和同源比對，筆者初步預(yù)測了13個(gè)可能參與脂肪酸代謝的基因，其中包括long chain acyl-CoA synthetase，glycerol-3-phosphate dehydrogenase，1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase，lysophospholipid acyltransferase等。隨后基于基因-基因、基因-代謝物、代謝物-代謝物間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，結(jié)合脂肪酸代謝途徑基因啟動子區(qū)cis-elements的潛在結(jié)合能力，在“Melightyellow”模塊中鑒定到了10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括ERF，MYB 和bHLH等。這些轉(zhuǎn)錄因子與“Melightyellow”模塊中鑒定的13個(gè)候選基因，差異積累的脂肪酸都表現(xiàn)出較高的相關(guān)性(圖4-B)。其中ADH (alcohol dehydrogenase,AZ13G0249870)基因參與 20-Hydroxyarachidonic acid 到 20-Oxoarachidonic acid (Cnm05349)的 合 成 ，而 LPC 18:1在LPCAT (lysophosphatidylcholine acyltransferase,AZ11G0210280)基因的參與下與Oleic acid結(jié)合生 成 Phosphatidylcholine (18:1/18:1, Cnm11965)(圖4-C)。研究發(fā)現(xiàn) 20-Oxoarachidonic acid和Phosphatidylcholine (18:1/18:1)在高種椰子中的含量顯著高于矮種椰子(圖4-D)，轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)也表明，ADH和LPCAT在高種椰子中有著更高的轉(zhuǎn)錄水平(圖4-E)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的可靠性，筆者通過qRT-PCR證實(shí)，ADH和LPCAT在高種椰子中的表達(dá)水平顯著高于黃矮椰子和綠矮椰子(圖4-F)。這些基因在高種椰子中的高水平表達(dá)可能是導(dǎo)致高種椰子脂質(zhì)含量顯著高于黃矮椰子和綠矮椰子的重要原因。

圖4 加權(quán)共表達(dá)分析鑒定與脂肪酸合成相關(guān)的基因

2.4 椰子脂質(zhì)合成途徑的重建脂質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表明高種椰子在脂質(zhì)積累水平和脂質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于矮種椰子。為了進(jìn)一步探究脂肪酸合成通路在高矮種椰子間是否存在差異，構(gòu)建了亞油酸相關(guān)的合成代謝通路。該通路由丙酮酸起始，在一系列酶的催化下生成亞油酸，亞油酸在酶的作用下最終生成茉莉酸甲酯(圖5)?；诘鞍椎耐葱躁P(guān)系，對椰子脂肪酸合成通路的基因進(jìn)行注釋，包括ACCase、FAD3、LOX2S、AOS、AOC、OPR、OPCL1、JMT等基因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的定量結(jié)果和代謝組的相對物質(zhì)含量，筆者發(fā)現(xiàn)在脂肪酸上游途徑，參與亞油酸、亞麻酸合成的的基因，如ACCase在高種椰子中的表達(dá)量高于矮種，而代謝物含量變化也與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)相一致。亞麻酸至9,10-Epoxy-10,12Z-octadecadienoate途徑和亞油酸至8,9-DiHETrE途徑及亞油酸至10-Oxo-11,15-phytodienoic acid和Heptadecatrienal途徑，相關(guān)的代謝物在高種椰子中也始終表現(xiàn)為高積累。在代謝通路下游，茉莉酸甲酯合成途徑中的關(guān)鍵基因如AOC、OPR、JMT等均在高種椰子中有著更高的表達(dá)水平，相關(guān)代謝物也在高種椰子中表現(xiàn)為高積累。以上結(jié)果均表明，高種椰子椰肉中的脂肪酸含量高于矮種椰子，這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因應(yīng)該是脂肪酸合成通路的基因大多在高種椰子中特異性高表達(dá)。

圖5 高矮種椰子脂肪酸合成途徑基因表達(dá)水平及代謝產(chǎn)物積累水平的比較

3 討 論

本研究不僅成功構(gòu)建了不同類型椰子椰肉組織的代謝數(shù)據(jù)庫，而且發(fā)現(xiàn)高種椰子的脂質(zhì)積累水平遠(yuǎn)高于矮種椰子，不同類型的椰子品種在脂質(zhì)的積累上具有特異性。此外通過整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)“Melightyellow”模塊與脂肪酸高度相關(guān)，并從中鑒定到了大量參與脂肪酸合成的結(jié)構(gòu)基因。筆者通過分析脂肪酸合成途徑基因啟動子區(qū)的cis-element，發(fā)現(xiàn)這些基因的啟動子區(qū)存在大量的激素信號響應(yīng)元件和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這表明MYB家族在脂肪酸合成調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且激素作為一種信號分子可能通過響應(yīng)外界環(huán)境條件的變化來參與到脂肪酸的合成途徑中。蠟質(zhì)主要由脂肪酸和相關(guān)衍生物構(gòu)成，目前大量的研究結(jié)果表明，蠟質(zhì)的合成受到多種環(huán)境因素的誘導(dǎo)，如干旱脅迫等[26]，ABA等激素可以正向調(diào)控蠟質(zhì)合成基因 的表 達(dá)[26-27]。 熊 程 等[28]的研 究結(jié) 果表 明，MYB31通過調(diào)控CER6的表達(dá)，協(xié)同調(diào)控番茄表皮蠟質(zhì)的合成，并且CER6的表達(dá)進(jìn)一步受到ABA的誘導(dǎo)。鞠延侖等[29]在葡萄中發(fā)現(xiàn)外源施加茉莉酸甲酯(MeJA)可以調(diào)控脂肪酸代謝途徑的脂氧合酶，進(jìn)而對葡萄的風(fēng)味造成影響。此外，研究者鑒定到大量的參與脂質(zhì)途徑的MYB轉(zhuǎn)錄因子，如MYB30和MYB41能夠調(diào)控超長鏈脂肪酸的合成來影響棉花纖維的伸長[30-31]，MYB96和MYB94能夠激活蠟質(zhì)合成基因的表達(dá)[32-33]，煙草中的MYB12a能夠促進(jìn)脂肪酸的降解等[34]，這些均與本研究的結(jié)果相契合。本研究通過結(jié)合共表達(dá)分析和分析脂質(zhì)途徑結(jié)構(gòu)基因啟動子區(qū)的ciselement，對模塊中可能參與脂質(zhì)途徑的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定，預(yù)測并構(gòu)建了椰子脂肪酸途徑的完整調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)脂肪酸途徑的進(jìn)一步解析提供了有力資源。本研究不僅闡明了高矮種椰子間脂肪酸差異及相關(guān)分子機(jī)制，而且可為椰子油脂的遺傳改良和高油脂椰子品種的選育提供一定的依據(jù)。