吳鐘解，唐 佳，蔡文啟，唐 凱，閆智聰，陳石泉，周 智

（1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院 海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心 海口 570228;2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院 海洋生態(tài)研究所 ?？?571126）

抗生素在醫(yī)療以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（如水產(chǎn)養(yǎng)殖）中已被廣泛應(yīng)用[1-3]。由于濫用抗生素及抗生素的處理不當(dāng)和去除效率低等原因，造成抗生素及其代謝物隨污水排放進(jìn)入河流、湖泊及海洋等水環(huán)境中。目前，從水環(huán)境中檢測到的抗生素濃度通常為每升水幾納克到幾百微克不等[4]，環(huán)境中殘留的抗生素能夠誘導(dǎo)抗生素耐藥菌（Antibiotic Resistance Bacteria， ARB）和 抗 生 素 抗 性 基 因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）的產(chǎn)生[5]。目前在醫(yī)院廢水、養(yǎng)殖廢水、天然水體、空氣和土壤等環(huán)境中均已檢測到ARGs[6]。ARGs已成為一種新型環(huán)境污染物[7]，具有傳播性和持久性的特點(diǎn)[8]，對生物健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響[9]。例如，ARGs能夠通過水平基因轉(zhuǎn)移（Horizontal Gene Transfer，HGT）促使未接觸過抗生素的病原菌獲得一種或者多種耐藥性，這些具有耐藥性的病原菌可能導(dǎo)致人類疾病治療失效、治療周期延長和死亡 率 增 加[10-11]。 因 此 ， 抗 生 素 耐 藥 性 （主 要 是ARB和ARG）已被世界衛(wèi)生組織納入21世紀(jì)以來嚴(yán)重威脅人類健康的挑戰(zhàn)之一[12]，相關(guān)研究已發(fā)展成全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有極高的初級生產(chǎn)力和生物多樣性，也因其較高的生態(tài)服務(wù)價(jià)值而備受關(guān)注，但全球氣候變化和人類活動已嚴(yán)重威脅到珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況[13-14]，其中，抗生素也已成為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的潛在威脅因素之一。文獻(xiàn)[15-16]的研究結(jié)果表明，南海珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中存在多種類型的抗生素（磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等）污染，總濃度最高可達(dá)441 ng·L-1。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示抗生素能擾亂珊瑚中微生態(tài)的平衡，對珊瑚的生長具有負(fù)面影響[17]。LIU等[16]也檢測到南海北部礁區(qū)海水中的ARGs（sul1、sul2、cfr、cmla、floR、qnrA，qnrD和qnrS）污染，總豐度為 2.11×104～8.00×106copies·L-1。由此可見，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)已面臨ARGs污染的威脅。此外，人類食用的魚類中約10%產(chǎn)自珊瑚礁區(qū)，珊瑚礁區(qū)的潛水觀光是濱海旅游區(qū)最受歡迎的項(xiàng)目之一，這些均能夠增加人類直接或間接感染ARGs的風(fēng)險(xiǎn)。綜上，查明珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中ARGs的賦存特征具有重大意義。

我國珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)屬于印度-太平洋區(qū)系，占全球珊瑚礁總面積的2.57%，主要分布在南海諸島和海南島周邊海域[18]。本研究選取海南島東海岸8個(gè)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)，測定了礁區(qū)海水中磺胺類、喹諾酮類和氯霉素類共3類7種ARGs（sul1、sul2、qnrB、qnrS、cmlA1-01，cmlA1-02和cmx(A)）的豐度和12種水質(zhì)參數(shù)（鹽度、5種營養(yǎng)鹽和7種金屬離子濃度），旨在闡明海南島東海岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中ARGs的賦存特征，以期揭示人類活動對海南島近岸生態(tài)系統(tǒng)中ARGs分布和傳播的影響，并為當(dāng)?shù)卣贫p少ARGs污染和保護(hù)珊瑚礁的對策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集于 2019 年 10 月選擇海南島東海岸8個(gè)礁區(qū)（東郊、銅鼓嶺、長圮港、龍灣、加井島、分界洲、后海和鹿回頭）作為采樣站點(diǎn)（圖1），其中，銅鼓嶺、分界洲、加井島、后海和鹿回頭是著名的旅游景點(diǎn)；加井島和分界洲遠(yuǎn)離海岸，受陸地污染較?。婚L圮港和東郊靠近河流匯集地，易受到生活污水與農(nóng)業(yè)廢水等陸源污染物影響，在長圮港附近還分布著大片養(yǎng)殖高位池[19-20]。

圖1 采樣站點(diǎn)

在每個(gè)采樣站點(diǎn)選擇3個(gè)不同深度（分別為3、6和9 m），采用有機(jī)玻璃采水器（北京普力特儀器有限公司，中國）采集2 L底層海水。立即用0.2 μm 聚碳酸酯膜（Merck Millipore公司，美國）過濾1 L海水，然后將濾膜置于凍存管中并置于干冰中保存，待用于后續(xù)的DNA提取和ARGs定量。剩余1 L海水的固定和運(yùn)輸方法具體參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》（GB 17378.4—2007）[21]。

1.2 海水水質(zhì)的檢測本實(shí)驗(yàn)中檢測的海水水質(zhì)指標(biāo)包括：鹽度、NH3--N、NO2--N、NO3--N、PO43--P、Hg、As、Cu、Pb、Zn，Cd 和 Cr。上述指標(biāo)的測定按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》（GB 17378.4—2007）和《海洋監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》（HY/T 147.1—2013）開展[21-22]，各檢測指標(biāo)的分析方法詳見表1。

1.3 海水 ARGs 豐度的測定在超凈工作臺中將濾膜剪碎后，采用 DNA Clean & Concentrator試劑盒（Zymo Research，美國）提取濾膜上的海水總DNA[23]，接著采用Nanodrop微量紫外分光光度計(jì)（Maestrogen，中國）和瓊脂糖凝膠電泳法測定海水總DNA的濃度、純度及完整性，將檢測合格的DNA樣品置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 構(gòu)建含有 ARGs片段的質(zhì)粒擴(kuò)增 ARGs片段，擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+plus），2 μL dNTP（2.5 mmol·L-1）， 1 μL 正 向 引 物 （10 μmol·L-1），1 μL 反向引物（10 μmol·L-1），1 μL DNA模板（所有海水總 DNA 的混合液），0.15 μL rTaq，17.35 μL DEPC 水；擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，35 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s、退火溫度 30 s、72 ℃ 1 min），72 ℃10 min，最后 4 ℃ 儲存；ARGs的引物序列及其退火溫度參考LU等[24]的研究，具體參數(shù)如表2所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程有限公司，中國）進(jìn)行目的片段的回收純化。將目的片段連接到pMD19-T載體[寶生物工程(大連)有限公司，中國]中并轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物技術(shù)有限公司，中國）。每種轉(zhuǎn)化中挑選至少3個(gè)單克隆菌落經(jīng)PCR鑒定并測序驗(yàn)證。選擇驗(yàn)證正確的陽性單克隆菌液過夜培養(yǎng)，按照SanPrep柱式DNA小量抽提試劑盒（生工生物工程有限公司，中國）說明書提取含有ARGs片段的質(zhì)粒。采用Nanodrop微量紫外分光光度計(jì)測定提取質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算ARGs的拷貝數(shù)[25]。

表 1 海水樣品檢測項(xiàng)目分析方法

表 2 引物序列及 PCR 反應(yīng)條件

式中，C代表質(zhì)粒濃度（ng·μL-1）；M=（載體片段堿基對+目的基因堿基對）×660，本研究所用pMD19-T 載體的長度為 2 692 bp。

1.3.2 檢測 ARGs的拷貝數(shù)采用 SYBR Green熒光定量PCR方法[16]檢測海水DNA中3類7種ARGs的拷貝數(shù)，包括磺胺類（sul1，sul2）、喹諾酮類（qnrB，qnrS）和氯霉素類 [cmlA1-01，cmlA1-02和cmx(A)]的 ARGs[12,24]。使用經(jīng)準(zhǔn)確定量濃度的質(zhì)粒制備含梯度濃度 ARGs（108～103copies·μL-1）的標(biāo)準(zhǔn)液DNA，最后采用熒光定量PCR儀（朗基Q2000B型，中國）定量標(biāo)準(zhǔn)液和海水DNA中的ARGs拷貝數(shù)，同時(shí)為確保反應(yīng)無污染設(shè)定空白對照（以DEPC水代替DNA模板，NTC）。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考廠家說明書進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)體系：10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara，日本 or寶生物工程（大連）有限公司，中國 ），0.8 μL 正向引物（10 μmol·L-1），0.8 μL 反向引物（10 μmol·L-1），2 μL DNA 模板（總量 ＜ 100 ng），6.4 μL DEPC 水；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，退火溫度 30 s），溶解曲線的溫度從 60 ℃升高至95 ℃。待反應(yīng)完成后，通過儀器自帶的軟件判定引物擴(kuò)增特異性（溶解曲線呈現(xiàn)單峰）。根據(jù)Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值 ＜ 33為陽性）與標(biāo)準(zhǔn)液DNA中ARGs拷貝數(shù)的對數(shù)值成反比線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2＞ 0.99），并計(jì)算待測海水 DNA 中的 ARGs拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析在 IBM SPSS Statistics 20 軟件中完成。采用Spearman相關(guān)性分析探索海水中ARGs的拷貝數(shù)和水質(zhì)參數(shù)間的相關(guān)性，以P＜ 0.05為差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)參數(shù)海水鹽度、營養(yǎng)鹽和金屬離子濃度見表3。各采樣地點(diǎn)海水中的平均Pb離子含量在 1.09～3.21 μg·L-1內(nèi)，符合Ⅱ類水質(zhì)設(shè)置的范圍（1～5 μg·L-1）。此外，鹿回頭礁區(qū)海水中的平均Zn 離子濃度為 20.59 μg·L-1，其數(shù)值在Ⅱ類水質(zhì)規(guī)定的閾值范圍內(nèi)（20～50 μg·L-1）。在 8 個(gè)珊瑚礁礁區(qū)中，銅鼓嶺、分界洲島和加井島礁區(qū)的水質(zhì)優(yōu)于其他站點(diǎn)，長圮港礁區(qū)中的營養(yǎng)鹽含量較高，而東郊、龍灣和鹿回頭礁區(qū)中部分金屬離子濃度較高。

表 3 不同珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中的水質(zhì)參數(shù)

2.2 海水中 ARGs 的豐度海南島東海岸珊瑚礁區(qū)海水中ARGs的豐度如圖2-A所示，在8個(gè)取樣站點(diǎn)均檢測到3類7種ARGs（sul1、sul2、qnrB、qnrS、cmlA1-01，cmlA1-02和cmx(A)），各站點(diǎn)ARGs的總拷貝數(shù)為 5.51×107～1.71×109copies·L-1。其中，長圮港具有最高的ARGs總拷貝數(shù)（1.71×109copies·L-1），分界洲次之（1.92×108copies·L-1），鹿回 頭 （5.74×107copies·L-1）和 加 井 島 （5.51×107copies·L-1）具有相對較低的 ARGs拷貝數(shù)。進(jìn)一步分析可知，sul2是所有取樣站點(diǎn)中占比最高的ARG，拷貝數(shù)范圍為 3.96×107～1.65×109copies·L-1，占各站點(diǎn)ARGs總拷貝數(shù)的68.99%～96.35%。cmx(A)的拷貝數(shù)在各站點(diǎn)中均為最低（2.08×105～3.48×106copies·L-1），低于各站點(diǎn) ARGs總拷貝數(shù)的 1.21%（圖2）。

圖2 海南島東海岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中抗生素抗性基因的分布特征

2.3 ARGs拷貝數(shù)和水質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性礁區(qū)海水中3類7種ARGs的豐度和水質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析如圖3所示，sul1、cmlA1-01、cmlA1-02、qnrS和cmx(A)與鹽度均呈顯著（P＜ 0.05）負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)（ρ）分別為-0.50、-0.54、-0.47、-0.48和-0.59。cmlA1-01和qnrS與NO2--N 顯著（P＜ 0.05）正相關(guān)，ρ分別為0.49和0.41。此外，磺胺類ARGsul1和銅離子濃度顯著正相關(guān)（ρ=0.41，P＜ 0.05），喹諾酮類ARGqnrB和鎘離子濃度顯著正相關(guān)（ρ=0.48，P＜ 0.05）。

圖3 礁區(qū)海水中抗性基因的豐度和水質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討 論

ARGs對海洋生物健康和生態(tài)環(huán)境造成的負(fù)面影響不容小覷。然而，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中ARGs污染的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道[16,26]。本研究調(diào)查了海南島東海岸8個(gè)岸礁生態(tài)系統(tǒng)中3類7種ARGs的分布，以及ARGs豐度與海水水質(zhì)指標(biāo)的聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)磺胺類、喹諾酮類和氯霉素類的ARGs普遍存在于海南島東海岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的海水中。與之類似，在海南東寨港、外伶仃島、廟灣島和大鵬灣區(qū)域的海水也檢測到上述類型的ARGs[16,27-28]。各研究中檢測的 ARGs 種類存在差異，因此很難比較ARGs的總拷貝數(shù)。在本研究中，長圮港中ARGs總拷貝數(shù)最高，分界洲次之，而鹿回頭和加井島較低。長圮港的高ARGs豐度可能與其所處區(qū)域現(xiàn)存的大量水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)密切相關(guān)。集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病頻發(fā)，促使抗生素使用增加[29-30]，從而造成嚴(yán)重的 ARGs污染。加井島和分界洲島均離岸較遠(yuǎn)，加井島屬于無人島，而分界洲島是著名的旅游景點(diǎn)，分界洲島比加井島居住著更多的居民和游客，人類和動物醫(yī)學(xué)中使用的抗生素通過廢水排放到海水中造成ARGs污染[31]。導(dǎo)致兩島ARGs總拷貝數(shù)出現(xiàn)差異的主要原因可能是生活污水的排放量不同。鹿回頭的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)位于國家級珊瑚礁保護(hù)區(qū)內(nèi)，附近酒店和游客數(shù)目相對較少，這也許是其低的ARGs總拷貝數(shù)的原因。在本研究中，海南島東海岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中存在多種類型的ARGs污染，ARGs的分布可能和水產(chǎn)養(yǎng)殖和生活污水排放等人類活動密切相關(guān)。

sul2是海南島東海岸珊瑚礁海水中占比最高的 ARGs，最高豐度為 1.65×109copies·L-1，其最高豐度值與海南島東寨港海水中的sul2豐度（5.13×108copies·L-1）相近[27]，低于長江下游水體中的 sul2豐度（3.30×108copies·mL-1）[32]。磺胺類抗生素已廣泛應(yīng)用于人類和動物醫(yī)學(xué)，其理化特征（低螯合能力、低結(jié)合常數(shù)、高水溶性和穩(wěn)定性）導(dǎo)致在水環(huán)境中易產(chǎn)生相應(yīng)的ARB，進(jìn)而促使磺胺類ARGs成為水環(huán)境中的主導(dǎo)類型[33]。本研究中cmx(A)含量較低的原因可能是這些地區(qū)氯霉素抗生素的污染水平較低?？傮w而言，珊瑚礁海區(qū)存在較高豐度的磺胺類ARGs，筆者推測長期高濃度的sul2污染可能會對珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生不利影響。

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中的ARGs能夠通過食物鏈以及潛水活動等方式進(jìn)入人體，威脅人類健康[34]。因此，積極探索影響ARGs的豐度及其傳播的環(huán)境因子顯得尤為重要。在本研究中，Spearman相關(guān)性分析表明，大部分ARGs（包括sul1、cmlA1-01、cmlA1-02、qnrS和cmx(A)）的豐度與海水鹽度顯著負(fù)相關(guān)。高鹽能夠抑制攜帶ARGs細(xì)菌的生長（通過影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能），進(jìn)而減少環(huán)境中ARGs的豐度[35]。同時(shí)，低鹽度的礁區(qū)可能與生活污水或河流注入有關(guān)，其中含有人類或動物醫(yī)學(xué)產(chǎn)生的抗生素可能誘導(dǎo)了高豐度的ARB和ARGs。BERGERON等[36]對沼澤樣品的研究表明，ARGs的豐度在低鹽條件下（6 PSU）多于在高鹽（12 PSU）條件下的。LIU 等[16]和阮孫蘭[25]的研究也表明部分ARGs的豐度和鹽度顯著負(fù)相關(guān)。室內(nèi)研究也表明高鹽能夠?qū)е滤w中ARGs豐度降低約50%[37]。此外，本研究揭示部分ARGs拷貝數(shù)與NO2--N，Cu和Cr離子濃度顯著正相關(guān)。ARGs豐度的變化可能和水體營養(yǎng)鹽成分的變化相關(guān)，富營養(yǎng)化的水體有利于ARB的生長，進(jìn)而促進(jìn)ARGs的傳播[4]。然而，阮孫蘭[25]的研究表明亞硝酸鹽和大多數(shù)目標(biāo)抗性基因成負(fù)相關(guān)，造成該差異的具體機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。作為抗生素的替代品，金屬化合物（例如CuSO4）被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中，用以預(yù)防疾病和促進(jìn)生物生長[37]。目前，已有多項(xiàng)研究表明重金屬對于抗生素抗性基因的分布和傳播具有重要作用[38]。金屬化合物能夠在環(huán)境中普遍并持續(xù)存在，金屬抗性基因通常與ARGs位于同一可移動遺傳元件（Mobile Genetic Element，MGE）上，促使重金屬在 ARGs增殖和傳播中起關(guān)鍵作用[39]。HU等[40]的研究也表明Cu離子濃度增加能夠促使環(huán)境中形成高豐度的ARGs。WARDWELL等[41]研究表明，泥沼樣品中Hg含量不僅能夠增強(qiáng)細(xì)菌對Hg的抗性，也能夠增加細(xì)菌的多重抗藥性。綜上所述，多種環(huán)境壓力的共同選擇，尤其是鹽度、營養(yǎng)鹽和金屬離子濃度的選擇及其誘導(dǎo)的細(xì)菌群落變化是ARGs在礁區(qū)海水中傳播的主要驅(qū)動因素。污水處理廠可通過嚴(yán)格控制這些環(huán)境因子，來減少礁區(qū)中抗性基因的輸入量。

本研究結(jié)果表明，海南島東海岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中存在ARGs污染，且水產(chǎn)養(yǎng)殖附近的礁區(qū)海水中ARGs污染程度最高。此外，ARGs的分布和海水鹽度、營養(yǎng)鹽和金屬離子濃度含量顯著相關(guān)。因此，通過調(diào)整環(huán)境中的鹽度、營養(yǎng)鹽和金屬離子濃度可影響礁區(qū)ARGs的傳播。