符丹鳳，劉洪濤，楊明秋，何玉貴

（1.海南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，?？?570226;2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院/海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571126）

斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)屬甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對(duì)蝦科(Penaeidae)對(duì)蝦屬(Penaeus)，又名黑虎蝦、草蝦，是當(dāng)今世界三大經(jīng)濟(jì)對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一。斑節(jié)對(duì)蝦是對(duì)蝦屬中體型最大的種類(lèi)，分布廣泛，主要在印度洋以及太平洋區(qū)域[1]。自20世紀(jì)80年代起，斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大。近年來(lái)，養(yǎng)殖環(huán)境污染引起的多種細(xì)菌病、病毒病等疾病大規(guī)模爆發(fā)，嚴(yán)重制約了斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其中，細(xì)菌病主要是由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維弧菌(V.harveyi)等十幾種病原菌引發(fā)[2]。有研究顯示，細(xì)菌脂多糖 (LPS) 是幾乎所有革蘭氏陰性細(xì)菌外表面膜的主要成分，并且是多種真核生物先天免疫反應(yīng)的極強(qiáng)刺激劑[3]。對(duì)蝦的先天性免疫是維持蝦健康的主要屏障，深入研究斑節(jié)對(duì)蝦先天免疫防御對(duì)控制對(duì)蝦疾病爆發(fā)和健康養(yǎng)殖具有重要意義。ML 蛋白 (MD-2-related lipid-recognition，MD-2脂質(zhì)識(shí)別蛋白) 家族是一類(lèi)廣泛分布于動(dòng)植物和真菌等生物體內(nèi)的多成員的蛋白家族，MD-2對(duì)于細(xì)菌脂多糖 (LPS) 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程和后續(xù)的促炎因子分泌過(guò)程至關(guān)重要[4]。這些蛋白分子較小，通常都具有1個(gè)約150個(gè)氨基酸殘基的ML結(jié)構(gòu)域，其中，至少含有2對(duì)保守的半胱氨酸[5]。不同的ML蛋白具有不同的氨基酸序列，從而形成具有差異的中央疏水腔，可結(jié)合不同的脂類(lèi)配體，產(chǎn)生脂類(lèi)識(shí)別的特異性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)功能[6]。ML蛋白家族成員眾多，因脂質(zhì)識(shí)別特異性導(dǎo)致其在不同生物體的分布位置及行使功能有很大不同[7]。對(duì)脊椎動(dòng)物中ML的研究較多，發(fā)現(xiàn)其在先天免疫和脂類(lèi)代謝上發(fā)揮重要作用，例如人類(lèi)MD-2參與Toll樣受體4 (Toll-like receptors 4, TLR4)識(shí)別細(xì)菌脂多糖 LPS，還可以直接結(jié)合LPS[8]，而人類(lèi)C型尼曼匹克蛋白2(Niemann-Pick type C2 protein, NPC2)具有很強(qiáng)的膽固醇結(jié)合能力，能快速轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇至膜受體從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)平衡[9]。無(wú)脊椎動(dòng)物中，ML的功能還未分化和明確，可能行使更為復(fù)雜多樣的生物學(xué)功用，研究發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的NPC2a就同時(shí)具備了相當(dāng)于脊椎動(dòng)物的 MD-2和 NPC2兩者的功能[10]。此外，ML家族還有相當(dāng)多功能不明確的蛋白有待深入研究。近年來(lái)，對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物ML基因的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)ML蛋白參與了宿主和病毒的相互作用[11]。在甲殼動(dòng)物中，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的LvML蛋白可能參與抗菌和抗病毒的先天免疫過(guò)程[12]；日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)的ML不僅通過(guò)識(shí)別WSSV的脂質(zhì)成分參與先天免疫應(yīng)答，還可能與幼體發(fā)育中的變態(tài)及蛻皮有一定的關(guān)聯(lián)[13-14]。本研究基于斑節(jié)對(duì)蝦的2個(gè)ML基因的相似片段，克隆獲得了它們的cDNA全序列，分析了其序列特征，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析目的基因蛋白在各組織的表達(dá)分布情況，為進(jìn)一步了解ML家族基因在斑節(jié)對(duì)蝦先天免疫中的作用提供資料。

1 材料與方法

1.1 試 驗(yàn) 材 料供 試 的 斑 節(jié) 對(duì) 蝦 (Penaeus monodon)來(lái)自海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊?？蒲谢馗呶怀兀?0 m×20 m×2 m）的養(yǎng)殖群體，平均單只體長(zhǎng)為（13.24±0.35）cm，平均單只的體質(zhì)量為（19.45±0.61）g，暫養(yǎng)于水泥池（9.7 m×1.5 m×1.3 m）中。暫養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取6尾身體完整無(wú)損傷的健康雌性個(gè)體，取其血細(xì)胞、眼柄、心、鰓、胃、腸、肝胰腺和肌肉，迅速置于RNAlater(ThermoFisher ,USA)中 4 ℃ 過(guò)夜后，-20 ℃ 長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

RNeasy Mini Kit購(gòu) 自 德 國(guó) Qiagen。 2×TaqPCR StarMix with Loading Dye、2×SuperStar Plus Mix with Loading Dye、 StarPrep Gel Extraction Kit和 EZ-Blunt Zero pTOPO II Cloning Kit等試劑盒均購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司(GenStar)。SMARTer RACE 5′/3′ Kit、PrimerScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR? Premix Dimer Eraser?(Perfect Real Time)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)以斑節(jié)對(duì)蝦 2 個(gè) ML 基因相似片段，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0 和分析軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行cDNA全序列的克隆[15]。以斑節(jié)對(duì)蝦延伸因子1α基因 (EF-1α)作為內(nèi)參基因，基于獲得的PmML1與PmML2的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。所有引物(表1)由深圳華大基因有限公司合成。

表 1 斑節(jié)對(duì)蝦 PmML1、PmML2克隆與表達(dá)所用引物

1.3 PmML1、PmML2 cDNA 克隆使用 RNeasy Mini Kit提取斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺組織總 RNA，取5 μL RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并使用ND-1000超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。使用 StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA 模板。

分別利用1對(duì)引物擴(kuò)增和驗(yàn)證斑節(jié)對(duì)蝦PmML1、PmML2的序列片段，PCR反應(yīng)體系(50 μL)： 無(wú) 菌 雙 蒸 水 (DDW) 22 μL， 12×TaqPCR StarMix 25 μL，正反向引物分別 1 μL，肝胰腺 cDNA模板 1 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物使用 StarPrep Gel Extraction Kit回收目的條帶，使用 EZ-Blunt Zero pTOPO II Cloning Kit連接，連接產(chǎn)物加入到 50 μL Trans5α Phage Resistant Chemically Competent Cell中轉(zhuǎn)化，菌液涂于氨芐青霉素(Amp+)抗性平板上， 37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取單菌落M13引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑取陽(yáng)性克隆送測(cè)序獲得目的片段序列?；隍?yàn)證的PmML1、PmML2的序列片段設(shè)計(jì)的RACE巢式引物，根據(jù) SMARTer RACE 5′/3′ Kit 試劑盒的方法說(shuō)明進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)的cDNA模板制備及PmML1、PmML2基因的 3′末端序列和 5′末端序列的擴(kuò)增測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析斑節(jié)對(duì)蝦 ML 基因的ORF區(qū)域及氨基酸序列使用NCBI的ORF Finder在線(xiàn)程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定[16]。利用 PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[17]。使用MAFFT在線(xiàn)軟件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析[18]。序列的比對(duì)、理化性質(zhì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建等參照文獻(xiàn)[19]的方法，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域和糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)等參照文獻(xiàn)[20]的方法。

1.5 PmML1與 PmML2 mRNA 的組織分布提取斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞、眼柄、鰓、心、胃、腸、肝胰腺與肌肉等8種組織總RNA，制備cDNA模板及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組織表達(dá)分布的方法參照文獻(xiàn) [17]的方法進(jìn)行，表達(dá)數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法[21]，用Excel2019軟件分析和展示檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑節(jié)對(duì)蝦2個(gè)ML基因序列及氨基酸序列分析根據(jù)測(cè)序結(jié)果，拼接獲得了斑節(jié)對(duì)蝦 2個(gè)ML基因的 cDNA全序列 (圖1)，分別命名為PmML1(GenBank:MZ291448)與PmML2(GenBank:MZ291449)。PmML1基因由 307 bp 的 5′非編碼區(qū) (5′-Untranslated Region,5′-UTR)、462 bp 的開(kāi)放閱讀框 (Open Reading Frame, ORF)和 911bp 的 3′-UTR組成，編碼153個(gè)氨基酸；PmML2基因由95 bp 的 5′-UTR、471 bp 的 ORF 和 574 bp 的 3′-UTR組成，編碼156個(gè)氨基酸。PmML1的氨基酸序列中Arg(R)、Val(V)和Ala(A)含量較高，相對(duì)分子質(zhì)量為 17 604.30，等電點(diǎn)為 6.11；PmML2 的氨基酸組成中Leu(L)和Ser(S)含量較高，相對(duì)分子質(zhì)量為17 719.52，等電點(diǎn)為6.94，說(shuō)明2個(gè)蛋白可能是差異較大的小分子蛋白。PmML1的疏水平均值 (GRAVY)為-0.035，為親水性蛋白；而PmML2的疏水平均值(GRAVY)為0.024，屬疏水性蛋白。2個(gè)蛋白的疏水性差異暗示其可能在不同的部位發(fā)揮生物學(xué)功能。此外，PmML1在71位發(fā)現(xiàn)1個(gè)“NSTN”基序的N-糖基化位點(diǎn)；PmML2在38和113位各有1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，在63位有1個(gè)“NLTA” 基序的N-糖基化位點(diǎn)。

圖1 斑節(jié)對(duì)蝦 PmML1（A）、PmML2（B）基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

預(yù)測(cè)顯示，PmML1蛋白N端存在1個(gè)具有20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽；而PmML2蛋白N端存在1個(gè)具有23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽(圖1)。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PmML1蛋白定位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體、液泡和高爾基體的比例分別為33.3%、22.2%、22.2%、11.1%和11.1%；而PmML2蛋白定位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡的比例分別為66.7%、22.2%和11.1%。2個(gè)基因的定位差異表明他們可能在細(xì)胞內(nèi)外執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。預(yù)測(cè)PmML1的半胱氨酸殘基可形成3對(duì)二硫鍵，位點(diǎn)依次為 31～145，45～103 和 52～97；PmML2半胱氨酸殘基可形成3對(duì)二硫鍵，位點(diǎn)依次為33～99，46～54和106～148。這些二硫鍵除了用于維持PmML1和PmML2分子內(nèi)構(gòu)象以單體發(fā)揮作用外，可能還會(huì)形成二聚體或寡聚體、多聚體來(lái)執(zhí)行某些生物學(xué)功能。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，PmML1蛋白中β-片層結(jié)構(gòu)占比31.37%；PmML2蛋白中β-片層結(jié)構(gòu)占比為31.41% (圖2)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，PmML1蛋白第52～150號(hào)氨基酸殘基之間有1個(gè)典型的ML super family結(jié)構(gòu)域(cl00274)；PmML2在第54～153號(hào)氨基酸殘基之間具有1個(gè)ML結(jié)構(gòu)域(smart00737)(圖2)。

圖2 PmML1（A）、PmML2（B）的 2 級(jí)結(jié)構(gòu)（上）與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（下）預(yù)測(cè)

2.2 PmML1、PmML2多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，PmML1和PmML2之間的相似性?xún)H為42.37%，除保守區(qū)外兩者的差異氨基酸會(huì)影響中央疏水腔結(jié)構(gòu)，進(jìn)而識(shí)別特異性脂類(lèi)，使得2個(gè)基因可能在斑節(jié)對(duì)蝦生理活動(dòng)中行使不同的功能。 PmML1與PmML2氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦等近緣動(dòng)物不同ML多重比對(duì)表明其ML蛋白結(jié)構(gòu)域及半胱氨酸位置相對(duì)保守(圖3)。PmML1與日本囊對(duì)蝦的ML蛋白MjML4相似性最高（91.5%）；PmML2與凡納濱對(duì)蝦ML蛋白(XP027236046.1)相似性最高（82.8%）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，PmML1和PmML2分別存在于2個(gè)不同的進(jìn)化分支，暗示2個(gè)基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)獨(dú)立，證明本研究中鑒定到的是2個(gè)不同的基因(圖4)。

圖3 PmML1 與 PmML2 氨基酸序列的多重對(duì)比

圖4 基于PmML1與PmML2氨基酸序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 PmML1、PmML2 的 mRNA 組織表達(dá)qRTPCR檢測(cè)PmML1和PmML2在斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺、鰓絲、胃、腸、心、肌肉、眼柄和血細(xì)胞等8種組織中的表達(dá)。從圖5可知，PmML1在8種組織中均有表達(dá)，以肝胰腺中表達(dá)量為對(duì)照，其在眼柄中表達(dá)量最高，其次為腸、胃、心、鰓、肌肉和肝胰腺，而在血細(xì)胞的表達(dá)水平最低。PmML2在8種組織中也均有表達(dá)，以肝胰腺中表達(dá)量為對(duì)照，其在眼柄中表達(dá)量最高，其次為腸、鰓、胃、血細(xì)胞、心、肝胰腺和肌肉，在肌肉中的表達(dá)水平最低。PmML2在眼柄的高表達(dá)，提示其可能參與了該部位重要器官X器官竇腺?gòu)?fù)合體調(diào)控的多種重要生理活動(dòng)。

圖5 PmML1（A）和 PmML2（B） mRNA 的組織表達(dá)分布

3 討 論

ML(MD-2-related Lipid-recognition)基因家族是由一類(lèi)具有ML單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)所組成，包括 MD-1、MD-2、GM2激活蛋白、Niemann-Pick型C2 (NPC2)蛋白和多種廣泛分布于動(dòng)植物及真菌的未知功能蛋白[6]。到目前為止，已有多個(gè)物種的ML家族基因被鑒定。例如，在果蠅（Drosophila melanogaster）基因組編碼8個(gè)ML家族基因，在岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)基因組編碼13個(gè)ML家族基因，在埃及伊蚊(Aedes aegypti)基因組中編碼24個(gè)ML家族基因[22]。本試驗(yàn)利用斑節(jié)對(duì)蝦2個(gè)ML相似片段，成功獲得斑節(jié)對(duì)蝦2個(gè)ML基因(PmML1、PmML2)的cDNA全序列，在斑節(jié)對(duì)蝦中尚屬首次。PmML1由153個(gè)氨基酸組成，由1個(gè)20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和3對(duì)半胱氨酸殘基的ML結(jié)構(gòu)域組成；PmML2由156個(gè)氨基酸組成，由1個(gè)23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和3對(duì)半胱氨酸殘基的ML結(jié)構(gòu)域組成，2個(gè)基因都符合ML蛋白多由140～160個(gè)氨基酸殘基組成的小分子量以及都有1個(gè)N端信號(hào)肽序列和至少2對(duì)保守的半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)特征[7]。因此，本研究獲得的2個(gè)基因都是ML基因家族的新成員。

ML蛋白的ML結(jié)構(gòu)域由多個(gè)β片層結(jié)構(gòu)組成，通過(guò)形成2個(gè)大的β折疊構(gòu)成1個(gè)Ig-like結(jié)構(gòu)的中央疏水腔[23]。該中央疏水腔通過(guò)包被脂類(lèi)配體的疏水部分促進(jìn)其溶解性并被膜上受體和酶所識(shí)別[7]。斑節(jié)對(duì)蝦PmML1和PmML2的2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其β片層結(jié)構(gòu)分別占比31.37%和31.41%；同源性和多重對(duì)比分析顯示，在配體結(jié)合部位兩者存在較高的序列變化，特別是疏水性氨基酸殘基的差異。說(shuō)明這兩個(gè)蛋白形成的中央疏水腔的結(jié)構(gòu)存在較大差異，能識(shí)別不同的特異性脂類(lèi)，在斑節(jié)對(duì)蝦生理活動(dòng)中可能行使不同的功能。這一結(jié)果在許多研究中也得到證實(shí)，例如MD-2結(jié)合TLR4的復(fù)合體除識(shí)別LPS外，還能識(shí)別紫杉醇、人衣原體HSP60、纖維粘連蛋白的功能結(jié)構(gòu)域等物質(zhì)[24]；而NPC2蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析則顯示其內(nèi)部疏水腔能結(jié)合1個(gè)膽固醇分子[25]。

ML蛋白的糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸殘基對(duì)ML蛋白正確行使功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究中，PmML1在71位點(diǎn)有1個(gè)“NSTN”基序的N-糖基化位點(diǎn)；PmML2在38和113位點(diǎn)各有1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，在63位點(diǎn)有1個(gè)“NLTA” 基序的N-糖基化位點(diǎn)。相關(guān)研究已證實(shí)，在糖基化位點(diǎn)發(fā)生突變后，MD-2仍可表達(dá)于細(xì)胞表面，并保持與TLR4結(jié)合，但輔助TLR4介導(dǎo)NF-kb的活化能力減弱，不能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)IL-8分泌，也不能活化 JNK 途徑[26-28]。在 NPC2 蛋白還發(fā)現(xiàn)不同的糖基化形式將決定其能否正確靶向溶酶體從而調(diào)節(jié)膽固醇的代謝水平[25,29]。本研究中，PmML1氨基酸序列中有7個(gè)半胱氨酸殘基，除1個(gè)位于信號(hào)肽序列外，剩余6個(gè)可形成3對(duì)二硫鍵，PmML2氨基酸序列中有8個(gè)半胱氨酸殘基，但其中有2個(gè)位于信號(hào)肽序列，剩余6個(gè)可形成3對(duì)二硫鍵。這些半胱氨酸殘基及其形成的二硫鍵，將對(duì)PmML1和PmML2蛋白的分子構(gòu)象及生物學(xué)功能發(fā)揮具有重要影響。半胱氨酸位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MD-2分子的寡聚化不依賴(lài)任何單一的半胱氨酸殘基，但95位和105位的半胱氨酸殘基突變將導(dǎo)致MD-2喪失與TLR4結(jié)合并賦予TLR4對(duì)LPS反應(yīng)的能力[28,30]。二硫鍵形成的共價(jià)結(jié)構(gòu)，能夠?yàn)樵S多蛋白質(zhì)提供基本的穩(wěn)定性并符合明確定義的幾何構(gòu)象[31]。MD-2蛋白半胱氨酸殘基構(gòu)成的二硫鍵可以形成分子內(nèi)二硫鍵，也可以由游離的二硫鍵在分子間連接形成穩(wěn)定的二聚體或寡聚體，多聚體，但單體MD-2比多聚體MD-2更易結(jié)合TLR4，能夠有效促進(jìn)TLR4對(duì)LPS的識(shí)別[32]。因此，筆者推測(cè)，MD-2 的二聚體、寡聚體、多聚體可能是MD-2單體避免被代謝掉的一種儲(chǔ)存形式，但具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

不同的ML家族蛋白在不同物種的分布具有很大的差異。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PmML1和PmML2基因在斑節(jié)對(duì)蝦鰓絲、肝胰腺等8種組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PmML1和PmML2在8種組織中均有表達(dá)，PmML1在眼柄表達(dá)量最高，而PmML2在眼柄中表達(dá)量最高，且與其他組織有明顯差異。總的來(lái)說(shuō)，PmML1和PmML2是在機(jī)體內(nèi)普遍存在的，但有組織偏好性，在眼柄中表達(dá)量最高，而在免疫組織中表達(dá)量相對(duì)較低。這在日本囊對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦等近緣物種的研究中也得到證實(shí)。例如，在日本囊對(duì)蝦的ML家族基因中，MjML1、MjML2和MjML4在各個(gè)檢測(cè)組織中均有分布，而MjML3和MjML5則僅在肝胰腺中表達(dá)[14]；在凡納濱對(duì)蝦中，LvML則僅在肝胰腺組織中表達(dá)[12]。位于對(duì)蝦眼柄的主要功能器官為X器官竇腺?gòu)?fù)合體(X-organ sinus gland complex, XO-SG complex)，是對(duì)蝦神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，在結(jié)構(gòu)和功能上類(lèi)似脊椎動(dòng)物的下丘腦-神經(jīng)垂體系統(tǒng)，它參與調(diào)控甲殼動(dòng)物血糖水平、生長(zhǎng)蛻皮和性腺發(fā)育等多種重要的生理活動(dòng)[33]。斑節(jié)對(duì)蝦中PmML1和PmML2在眼柄的高表達(dá)，暗示這2個(gè)基因可能主要在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控作用。PmML1和PmML2在多個(gè)免疫組織表達(dá)量相對(duì)較低，暗示PmML1、PmML2 2種蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程可能不是和免疫反應(yīng)直接相關(guān)的。此外，徐伊樺等[13]對(duì)日本囊對(duì)蝦MjML的研究發(fā)現(xiàn)，其ML蛋白可能參與了對(duì)蝦的變態(tài)及蛻皮等重要生理過(guò)程。本研究的2個(gè)ML蛋白或許具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。綜上所述，可以認(rèn)為PmML1和PmML2是ML基因家族的新成員，可能在斑節(jié)對(duì)蝦先天免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。