柴儷洪，楊 恒，張艷華，張麗娟，楊 仝

（天津市康婷生物工程集團有限公司，天津 300385）

引言

靈芝孢子是由蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、維生素類、甾醇類、三萜類、生物堿類、脂肪酸類、內(nèi)脂和無機離子類等化學成分組成[1]。靈芝孢子粉膠囊是由靈芝孢子粉單一成分組成，具有健脾益氣、養(yǎng)心安神的功效[2]。

經(jīng)研究，靈芝孢子粉中的粗多糖成分具有調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)定及消炎作用、提高機體耐缺氧能力。目前靈芝孢子粉產(chǎn)品廣受消費者青睞，但市場亂象叢生，甚至某些商家出現(xiàn)銷售無國家標準保健品文號的產(chǎn)品，質(zhì)量難以保障。因此，為了比較、評價以粗多糖為有效成分的靈芝孢子粉產(chǎn)品的質(zhì)量，關(guān)于粗多糖含量檢測方法的研究具有重要的實際意義[3]。目前關(guān)于多糖的檢測方法主要是以《保健食品功效成分檢測方法》一書為依據(jù)，國家目前未出臺關(guān)于多糖含量檢測的統(tǒng)一標準，且市場上各公司制備工藝也不盡相同。

本文采用硫酸-蒽酮法對本公司自制靈芝孢子粉的粗多糖含量進行檢測，研究并分析粗多糖提取和測定過程的最佳控制條件，為粗多糖的測定提供實踐依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與試劑

瑞倪維兒破壁靈芝孢子粉膠囊，天津市康婷生物工程集團有限公司；葡萄糖標準物質(zhì)，中國計量科學研究院提供（批號：2001）；無水乙醇（優(yōu)級純，批號20210511）、蒽酮（分析純，批號20191024）、濃硫酸（優(yōu)級純，批號20210207），國藥集團化學試劑有限公司。

數(shù)顯恒溫水浴鍋，博迅，型號HHS21-4；紫外可見分光光度計，Perkin Elmer，型號Lambola 265；高速常溫離心機，Thermo，型號ST16；微量分析天平，梅特勒，型號XSR304；冰箱冷藏柜，Thermo，型號PLR-386。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖提取過程

稱取1.2 g～1.3 g 樣品置于100 mL 棕色容量瓶中，加入80 mL 水，放入100 ℃水浴鍋中煮沸一段時間后冷卻至室溫，定容至刻度線搖勻。

1.2.2 樣品溶液制備過程

將上述溶液取出45 mL 置于50 mL 塑料離心管中，以4 000 r/min 速度離心5min，過濾棄去約10 mL初濾液，取5 mL 續(xù)濾液置于另一50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 無水乙醇搖勻，放入4 ℃冰箱中過夜。

從冰箱中取出放置室溫搖勻后，以4 000 r/min 速度離心10 min，棄去上清液，殘渣加10 mL 一定濃度乙醇溶液搖勻，反復操作3 次。殘渣加一級水溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL 容量瓶中并定容至刻度線搖勻后，吸取2 mL 置于25 mL 玻璃比色管中，再加入6 mL 硫酸-蒽酮溶液作為待測樣品溶液。

1.2.3 粗多糖測定過程

取0.1 g 葡萄糖標準物質(zhì)于10 mL 容量瓶中，并用一級水溶解定容至刻度線搖勻，作為葡萄糖標準儲備液。取1 mL 葡萄糖標準儲備液置于100 mL 容量瓶中，用一級水定容至刻度線，作為葡萄糖標準中間液。向7 支25 mL 玻璃比色管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標準中間液，加入一級水至2 mL并搖勻。向各玻璃管中加入6 mL 硫酸-蒽酮溶液并搖勻，作為標準系列溶液。

標準系列溶液和待測樣品溶液一同置于沸水浴20 min 后，放冷至室溫。于620 nm 處測定標準系列溶液和待測樣品溶液吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗多糖提取過程

2.1.1 提取時間

稱取8 份1.25 g 樣品于100 mL 棕色容量瓶中，各瓶均加入90 mL 一級水，同時置于100 ℃水浴鍋中依次煮至30、40、50、60、90、120、150、180 min。由下頁表1 看出，隨提取時間的增加，吸光度明顯提高，當提取時間達到90 min 時，吸光度最大；超過90 min 后吸光度開始下降。因為提取時間延長有利于粗多糖的溶出[3]，但時間過長引起糖結(jié)構(gòu)變化甚至使碳鍵斷裂而導致粗多糖吸光度下降[4]。同時考慮能耗問題，因此控制水浴時間在90 min 為宜。

表1 提取時間

2.1.2 浸提頻次

稱取6 份1.25g 樣品于100 mL 棕色容量瓶中，各瓶均加入90 mL 一級水于100 ℃水浴中加熱90 min，在加熱過程中對各瓶依次進行0、5、10、15、20、30 min/次浸提。由表2 看出，經(jīng)過浸提樣品吸光度均高于未經(jīng)過浸提樣品，經(jīng)5、10、15 min/次浸提過樣品的吸光度較高，但相差不大，20、30 min/次浸提過樣品的吸光度稍低。因為增加浸提過程可促進粗多糖溶出，但浸提次數(shù)過多提取效果并不明顯。因此控制浸提頻次在20 min/次為宜。

表2 浸提頻次

2.2 粗多糖測定過程

2.2.1 乙醇濃度

稱取6 份1.25g 樣品于100 mL 棕色容量瓶中，各瓶均加入90 mL 一級水于100 ℃水浴中加熱90 min，浸提頻次為20 min/次。樣品溶液制備過程同上述1.2.2 所示，殘渣依次加入70、75、80、85、90、95%乙醇進行洗滌沉淀。由表3 看出，隨乙醇濃度增加，吸光度逐漸增加，當乙醇體積分數(shù)達80%以上吸光度趨于平緩。因為粗多糖可溶于水不溶于乙醇，乙醇濃度越高，沉淀粗多糖相對分子質(zhì)量越大，且在乙醇濃度低時水溶液帶走部分粗多糖，導致吸光度減少。同時，由于樣品在提取過程中趨于平衡，乙醇濃度過大也無法明顯提高吸光度。因此乙醇體積分數(shù)控制在80%為宜。

表3 乙醇體積分數(shù)對吸光度的影響

2.2.2 硫酸濃度

粗多糖提取過程同上述2.2.1 所示。樣品溶液制備過程同上述1.2.2 所示，殘渣以80%乙醇進行分離沉淀。測定過程中向各比色管中分別加入70、75、80、85、95、100%濃度硫酸的0.1%硫酸蒽酮試劑。由表4看出，當硫酸體積分數(shù)達到80%時吸光度最大，硫酸體積分數(shù)達80%以上吸光度變化不明顯。因為糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基呋喃甲醛，再與蒽酮縮合成藍綠色化合物，其呈色強度與溶液中糖濃度成正比。因此硫酸濃度越大，在加入相同體積0.1%硫酸蒽酮試劑和相同加熱條件下，生成羥甲基呋喃甲醛越多，其吸光度越大。同時考慮試劑消耗問題，因此控制硫酸體積分數(shù)在80%為宜。

表4 硫酸體積分數(shù)對吸光度影響

3 精密度和準確度保證

3.1 標準曲線繪制

根據(jù)上述1.2.3 粗多糖測定過程制備標準系列溶液，測得結(jié)果如圖1 所示。

圖1 標準曲線

3.2 精密度

以破壁靈芝孢子粉樣品（批號：20211128）為供試品，測定6 次其粗多糖含量。粗多糖含量如表5 所示。由表5 得知，6 次測定結(jié)果相對標準偏差（RSD）為1.7%。

表5 精密度

3.3 準確度

對破壁靈芝孢子粉樣品（批號：20211128）進行加標回收實驗，每種水平加標平行測定6 次。葡萄糖標準物質(zhì)加標回收率在92.4%～97.1%。

4 結(jié)論

采用硫酸蒽酮法測定破壁靈芝孢子粉，在提取過程中控制水浴90 min，浸提頻次20 min/次；在測定過程中控制乙醇體積分數(shù)80%，硫酸體積分數(shù)80%條件下，檢測效果較優(yōu)。