李新宇，馬衛(wèi)華，杜亞麗，徐 凱，姜玉鎖

(1.山東輕工職業(yè)學院，山東淄博 255300；2.山西農業(yè)大學園藝學院，山西太原 030031；3.山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801；4.吉林省養(yǎng)蜂研究所，吉林吉林 132001；5.山西農業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801)

溫度是影響昆蟲生理狀況和生存狀態(tài)的重要非生物因素。蜜蜂屬于變溫動物，其個體保持和調節(jié)體溫的能力不強，外界環(huán)境溫度的變化會對蜜蜂生理代謝產生影響，如導致蜜蜂的應激反應、改變生理代謝、影響成蟲的存活、幼蟲的發(fā)育等(Kiuchietal.,2008;Bauerfeind and Fischer,2013;Colinetetal.,2018)。當外界環(huán)境溫度超過蜜蜂所能承受的范圍時，蜜蜂的各項生命活動和體內的生理代謝都會受到嚴重的干擾。

高溫可以改變細胞的內環(huán)境，對細胞骨架造成損傷，還會影響蛋白質的合成過程(杜堯等,2007)。蜜蜂在長期的進化過程中進化出了一系列措施來應對溫度脅迫，如調整自身代謝，合成保護蛋白等，以減緩或者修復高溫脅迫對機體造成的傷害。其中最顯著的機體響應就是抗逆蛋白的誘導產生，目前來說，在眾多抗逆基因中，熱激蛋白基因家族發(fā)揮著極其重要的作用，它是生物細胞在面臨多種應激條件下所產生的一類維持細胞內蛋白質平衡的蛋白(Feder and Hofmann,1999)。熱激蛋白具有能夠維持細胞骨架穩(wěn)定、抑制蛋白質變性、恢復變性蛋白原有的空間結構和生物活性的生物功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)了很多參與昆蟲抗逆的基因，其中以熱激蛋白基因為主(Huangetal.,2007)，其次還包括鋅指蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等(Krupaetal.,2004;Duanetal.,2008)。

鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)通常是指蛋白結構中含有一段自身折疊形成的手指狀結構，且常與Zn2+結合的一類蛋白質。最早的鋅指蛋白是在非洲爪蟾卵母細胞中發(fā)現(xiàn)的(Frankel and Pabo,1988)，之后，許多其他鋅指蛋白又被陸續(xù)鑒定出來。鋅指蛋白在真核生物中廣泛分布，通常由半胱氨酸和組氨酸組成，通過與Zn2+結合來維持結構的穩(wěn)定性；其結構非常多樣，其中絕大多數(shù)鋅指蛋白為類C2H2鋅指、高音譜號鋅指、鋼卷尺狀鋅指(趙楠等,2009)。鋅指蛋白具有許多不同的功能，包括轉錄的調節(jié)、細胞凋亡的調控、蛋白質折疊和組裝以及脂質結合等。隨著對鋅指結構研究的深入，許多具有新型拓撲結構的鋅指蛋白逐漸被人們認識到，這些發(fā)現(xiàn)可幫助進一步了解鋅指蛋白的生物學功能。例如，通過對經(jīng)典的C2H2結構的鋅指蛋白的深入研究使人們對其與DNA結合的機制有了新的認識(Johnetal.,2001)。鋅指蛋白作為一類轉錄因子，不僅可以調控基因的表達和細胞的分化，還在動植物抗逆方面發(fā)揮重要作用。鋅指蛋白能在轉錄水平上調控，是由于它能與生物大分子結合，或者通過鋅指蛋白間的結合，調控基因轉錄。Zn2+是影響鋅指蛋白功能的關鍵因素，可以通過鋅指結構，使激活子蛋白與增強子序列特異性結合而調節(jié)基因的表達。鋅指蛋白參與生物體應對多種生物或非生物因素脅迫的抗逆機制(Girietal.,2011)，在機體應對高溫脅迫時，多個鋅指蛋白基因在其轉錄后調控機制中發(fā)揮著重要的作用(Drolletal.,2013)。

ZFP37是C2H2型鋅指蛋白家族中的一員，被認為在轉錄調控中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，ZFP37主要在成年小鼠睪丸和大腦中表達，這表明其可能在控制小鼠精子生成中發(fā)揮潛在的作用(Payenetal.,1998)。同樣的，ZFP37也被發(fā)現(xiàn)參與調控豬子宮內膜上皮細胞的凋亡(Zhangetal.,2019)?，F(xiàn)階段，對于ZFP37的生物功能的研究多集中在小鼠和哺乳動物的生殖代謝上，在昆蟲中的作用鮮見報道。

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國本土蜂種，其生活習性適應了我國多變的自然環(huán)境，對于維持我國生態(tài)平衡起著重要作用(Zhangetal.,2014)，相比其他常見蜂種，中華蜜蜂具有抗逆性和抗螨能力強等優(yōu)勢(曾志將等,2002;Yang,2005)。本試驗根據(jù)之前的研究結果，選取中華蜜蜂在高溫脅迫下響應較強的一個基因ZFP37，對其蛋白結構進行預測分析，研究脅迫溫度和脅迫時間對其表達的影響，以探究中華蜜蜂在遭受熱脅迫時ZFP37可能發(fā)揮的生理功能，為蜜蜂抗熱機制的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗所需中華蜜蜂由山西農業(yè)大學動物科技學院實驗蜂場提供，選取健康無病蜂群3群。每群各選取1～2張老熟的封蓋子脾，置于34℃±0.5℃和RH 75%～80%條件下孵育。待幼蜂大量出房后，收集出房幼蜂并標記(N=500/群)，將標記的幼蜂放回原蜂群飼養(yǎng)，采集20日齡的標記蜜蜂作為試驗樣品。

1.2 溫度脅迫

從每群隨機選取300頭標記的20日齡工蜂，將蜜蜂隨機分為若干組，置于15 mL離心管中，每管放置1頭蜜蜂，離心管上扎有小孔，確保蜜蜂處于設置的溫濕度條件下，之后將試驗蜜蜂放入恒溫恒濕箱中，濕度設置為RH 30%，溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，脅迫2 h。高溫不同脅迫時間的處理為：在45℃，RH 30%條件下分別脅迫處理0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，其中0 h 處理組的蜜蜂直接采自蜂箱中的標記蜜蜂。處理完成后，隨機選擇5頭蜜蜂作為1個生物學重復用于提取RNA，每個處理組包括3個生物學重復，立即將蜜蜂投入液氮中，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒(Ambion)，PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit試劑盒(TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒(TaKaRa)，HWS0358恒溫恒濕箱(江南儀器廠)，Veriti?96 well梯度PCR儀(ABI)，7500熒光定量PCR儀(ABI)，ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop)，紫外凝膠成像儀(BIO-RAD)，DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀，5810R高速冷凍離心機(Eppendorf)。

1.4 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

使用Trizol試劑盒提取不同樣品總RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析提取的RNA質量，最后將提取的RNA反轉錄為cDNA。

1.5 引物設計

通過東方蜜蜂全基因組測序數(shù)據(jù)(NC_014295.1)，查找中華蜜蜂ZFP37基因序列，根據(jù)所得序列的CDS區(qū)使用Primer 3軟件設計RT-qPCR引物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 RT-qPCR反應

將cDNA模板稀釋備用，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行RT-qPCR反應。反應體系總體積為10 μL，其中包括5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII，1 μL cDNA，0.2 μL ROX Reference Dye II (50×)，上、下游引物各0.4 μL，無菌水 3 μL。qRT-PCR熱循環(huán)程序如下：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，45個循環(huán)。用β-actin作為內標基因，每個組織樣本重復測定3次。

1.7 序列分析

通過多種生物信息學軟件對中華蜜蜂ZFP37的序列進行預測分析，所用各軟件如表2。

表2 生物信息學分析所用軟件Table 2 Software for bioinformatics analysis

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對于qRT-PCR試驗結果，根據(jù)標準曲線以及熒光曲線的Ct值，采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。運用SPSS 21軟件中的單因素ANOVA方法進行數(shù)據(jù)分析(P<0.05)，正態(tài)性檢驗，方差齊性檢驗，對于未通過這些檢驗的數(shù)據(jù)，使用Kruskal-Wallis H檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 中華蜜蜂ZFP37編碼蛋白分析

分析中華蜜蜂ZFP37基因序列后發(fā)現(xiàn)，其開放閱讀框(ORF)全長1 413 bp。該基因編碼123個氨基酸，分子量為13.7 kDa，其中包含19種常見氨基酸，不含Trp；Lys含量最高(8.1%)，Tyr含量最低(1.6%)，等電點為8.72，脂溶指數(shù)為53.09，平均親水力為-0.737，不穩(wěn)定系數(shù)為39.41。

2.2 中華蜜蜂ZFP37的信號肽、跨膜結構、糖基化位點、磷酸化位點預測

中華蜜蜂ZFP37信號肽預測結果顯示，其全部氨基酸的S值均在閾值以下，表明其無信號肽區(qū)域(圖1)?？缒そY構預測結果顯示中華蜜蜂ZFP37各氨基酸的預測值均大于閾值1，說明蛋白全部在膜外，無跨膜結構，不屬于膜蛋白(圖2)。

圖1 中蜂ZFP37信號肽結構的預測Fig.1 Predicted signal peptide of AcerZFP37

圖2 中蜂ZFP37跨膜結構的預測Fig.2 Predicted transmembrane regions of AcerZFP37

蛋白糖基化位點預測結果表明，該蛋白Thr60的O糖基潛力值高于閾值0.5達到0.756，說明中華蜜蜂ZFP37存在O糖基化位點；N-糖基化位點預測顯示所有位點潛力值均小于閾值，未預測到帶相應的N糖基化位點(圖3)。蛋白磷酸化位點預測結果表明：中華蜜蜂ZFP37存在磷酸化位點，且出現(xiàn)在絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr以及酪氨酸Tyr這 3種氨基酸殘基上。包含12個磷酸化位點，分別是Ser20、Thr21、Ser29、Thr39、Thr60、Ser67、Ser68、Tyr69、Ser70、Tyr78、Ser83、Ser107(圖4)。

圖3 中蜂ZFP37糖基化位點的預測Fig.3 Predicted glycosylation of AcerZFP37

圖4 中蜂ZFP37磷酸化位點的預測Fig.4 Predicted phosphorylation sites of AcerZFP37

2.3 中華蜜蜂ZFP37蛋白二級結構和三級結構預測

中華蜜蜂ZFP37蛋白二級結構的預測結果顯示：中華蜜蜂ZFP37的二級結構主要包括3種結構：α螺旋、股和環(huán)，所占比例分別為8.13%、10.57%和81.3%。而三級結構中主要包括α螺旋和β折疊(圖5)。

圖5 中蜂ZFP37二級結構和三級結構的預測Fig.5 Predicted secondary and tertiary structure of AcerZFP37注：A，中蜂ZFP37的二級結構；B，中蜂ZFP37的三級結構。Note:A,Secondary structure of AcerZFP37;B,Tertiary structure of the AcerZFP37.

2.4 中華蜜蜂ZFP37的進化樹分析

根據(jù)NCBI Blast檢索到若干膜翅目昆蟲ZFP37氨基酸序列，并利用MEGA 7.0軟件構建包含中蜂在內的系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹結果如圖6，結果顯示：構建系統(tǒng)進化樹所用的昆蟲聚類主要分為3個分支，第一分支由中華蜜蜂、大蜜蜂Apisdorsata、迴條蜂Habropodalaboriosal、駝切葉蟻Cyphomyrmexcostatus和切葉蟻Acromyrmexechinatior組成，第二分支為小蜜蜂Apisflorea和美洲東部熊蜂Bombusimpatiens，而第三分支則為佛羅里達弓背蟻Camponotusfloridanus、歐洲熊蜂Bombusterrestris和西方蜜蜂Apismellifera。其中，中華蜜蜂ZFP37序列與大蜜蜂的相似性最高，而與其他膜翅目昆蟲的相似性存在差異，表明其具有較高的變異性。

圖6 不同昆蟲ZFP37氨基酸序列所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of ZFP37 from different insect species based on amino acid sequences注：中華蜜蜂，Apis cerana cerana，PBC34093.1；西方蜜蜂，Apis mellifera，XP 006562781.1；小蜜蜂，Apis florea，XP 003694613.1；大蜜蜂，Apis dorsata，XP 031367390.1；歐洲熊蜂，Bombus terrestris，XP 012166515.1；美洲東部熊蜂，Bombus impatiens，XP 003492637.1；佛羅里達弓背蟻，Camponotus floridanus，XP 025268432.1；迴條蜂，Habropoda laboriosal，KOC69890.1；駝切葉蟻，Cyphomyrmex costatus，KYN01212.1；切葉蟻，Acromyrmex echinatior，EGI62930.1。

2.5 不同溫度脅迫對中華蜜蜂ZFP37表達的影響

中華蜜蜂(20日齡成蜂)暴露于不同溫度下(25℃、30℃、35℃、40℃和45℃)2 h，ZFP37在不同溫度下的mRNA相對表達量會受高溫脅迫的影響，不同溫度處理間的表達存在顯著差異(P<0.05)，ZFP37的表達模式，從25℃至45℃間總體上表現(xiàn)出前低后高的趨勢，高溫處理能使ZFP37表達上調，尤其是45℃處理組。ZFP37在45℃時表達量最高，且顯著高于其他處理組(P<0.05)。

圖7 中華蜜蜂ZFP37在不同溫度下的mRNA相對表達量Fig.7 Relative expression levels of ZFP37 mRNA in response to different temperature treatments注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同的字母表示不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。Note:Data were mean±SE.Different letters above bars indicated significant difference at the 0.05 level between different temperature treatments.Same below.

2.6 不同脅迫時間對中華蜜蜂ZFP37表達的影響

中華蜜蜂(20日齡成蜂)暴露于45℃不同處理時間下(0 h、0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)，ZFP37在不同處理時間下的mRNA相對表達量會受高溫脅迫時間的影響，不同脅迫時間處理組的表達存在顯著差異(P<0.05)，ZFP37的表達模式從0 h至2 h間總體上表現(xiàn)出前低后高的趨勢，說明處理時間的延長能使ZFP37表達上調。ZFP37在1.5 h表達水平最高，顯著高于0 h和1 h處理組(P<0.05)，0 h表達量最低，且顯著低于其他處理組(P<0.05)。

圖8 中華蜜蜂 ZFP37在不同脅迫時間下的mRNA相對表達量Fig.8 Relative expression levels of ZFP37 mRNA in response to different process time

3 結論與討論

鋅指蛋白作為一類具有鋅指結構的轉錄因子在真核生物中分布十分廣泛，在動植物、酵母等真菌中都有發(fā)現(xiàn)(Caoetal.,2016;Yuanetal.,2018)。鋅指蛋白參與生命調控的方式主要是與DNA、RNA或蛋白質進行結合，之后在轉錄水平或翻譯水平上對相關生命活動進行調控。研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白能夠參與到生物的基因調控、細胞分化、胚胎發(fā)育、應激反應等生命過程(Nakashimaetal.,2002;Jangetal.,2016;Imbeaultetal.,2017)。動植物在環(huán)境壓力脅迫下，其體內多個調控蛋白的基因會表達增加，進而調控下游效應基因，改變機體的生理代謝并引發(fā)相應的應激反應，幫助生物體應對環(huán)境脅迫(Hranitzetal.,2010;kerletal.,2010;Liuetal.,2012;Guanetal.,2016)。本研究發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂ZFP37無跨膜結構域，不屬于膜蛋白，這一結果也與其轉錄因子的身份相對應。通過序列比對發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂ZFP37的序列與蜜蜂科昆蟲的相似性最高，而與其他膜翅目昆蟲相似性存在差異，這可能與昆蟲的生活環(huán)境和習性有關。

蜜蜂在面對各種環(huán)境脅迫時會作出相應的應激反應，其中合成抗逆蛋白是最主要的抗逆方式，常見的抗逆蛋白主要有熱激蛋白和鋅指蛋白等。而研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲遭受溫度脅迫后，一些抗逆基因的高表達能提高昆蟲耐受性，在眾多抗逆基因中，熱激蛋白基因家族發(fā)揮著極其重要的作用，在多種應激條件下機體產生的熱激蛋白可以顯著提高生物的耐受性(Huangetal.,2007)。鋅指蛋白的轉錄調控作用在昆蟲響應環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用(Andrewetal.,2006)，因此，鋅指蛋白是幫助生物體應對各類脅迫的重要抗逆蛋白，在生物體抗逆過程中的調控作用一直受到研究者的關注。

本研究結果表明ZFP37在不同溫度下的表達模式存在顯著差異，在45℃處理下表達水平最高，說明高溫能顯著提高ZFP37的表達水平，中華蜜蜂ZFP37的表達受高溫脅迫的誘導，ZFP37能對高溫脅迫做出快速的響應。同樣的，高溫下不同脅迫時間的處理結果顯示，中華蜜蜂ZFP37的表達受脅迫時間的誘導，長時間的高溫脅迫可以導致ZFP37表達增加。因此在高溫脅迫下，多個鋅指蛋白基因被激活，其中既有表達上調的，也有表達下調的，推斷ZFP37的活化可能是蜜蜂調節(jié)耐受性的一項重要機制。參考對意大利蜜蜂ApismelliferaligusticaZFP37的研究結果，發(fā)現(xiàn)兩者ZFP37的氨基酸組成及蛋白各項理化性質非常相似，中華蜜蜂和意大利蜜蜂的ZFP37均無信號肽區(qū)域，都屬于無跨膜結構的膜外蛋白，都含有相應的O糖基化位點和磷酸化位點，且兩者的二、三級結構也較為相似，這一結果也與兩者親緣關系較近這一情況相對應。本研究認為ZFP37在中華蜜蜂和意大利蜜蜂體內的作用是相似的，都可能參與了蜜蜂抗逆過程的代謝調節(jié)。蜜蜂調節(jié)耐受性的一項重要機制鋅指蛋白對蜜蜂的耐熱性具有重要的調節(jié)作用，但其具體的調節(jié)機制仍不清楚，還需要進一步的深入研究。