魏秋蘭，吳瓊芳，鄧惠敏，朱子丹

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，華南師范大學(xué)昆蟲(chóng)科學(xué)與技術(shù)究所，廣東省昆蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

昆蟲(chóng)是陸地上種類最多、數(shù)量最大且分布最廣的生物。在長(zhǎng)期自然演化過(guò)程中，昆蟲(chóng)形成了蛻皮與變態(tài)這一特殊且重要的發(fā)育特征，而這一特征主要受到蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenile hormone，JH)協(xié)同調(diào)控(Riddifordetal.,2003;Jindraetal.,2013)。20E與其受體復(fù)合物EcR-USP(Ecdysone receptor,EcR；Ultraspiracle,USP)結(jié)合后，啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控蛻皮與變態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致蛻皮與變態(tài)(Riddifordetal.,2000;2008;Yamanakaetal.,2013)的發(fā)生。JH則與其受體MET/Tai(Methoprene,MET；Taiman,Tai)結(jié)合，啟動(dòng)其下游的初級(jí)反應(yīng)基因Kruppelhomolog1(Kr-h1)表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)了JH級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)與發(fā)育(Kayukawaetal.,2012;2017)。近年來(lái)許多研究逐步完善了20E與JH調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)與變態(tài)的機(jī)制，但二者確切的互作機(jī)制有待深入闡釋。Li等發(fā)現(xiàn)，果蠅鈣調(diào)同源結(jié)構(gòu)域蛋白Chd64(Calponin homology domain protein,21-kDa Calponin-like protein,Chd64)可與JH反應(yīng)元件(JH-response element,JHRE)結(jié)合，還可通過(guò)與核受體Methoprene-tolerant(Met)和USP互作響應(yīng)JH誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(Lietal.,2007)。另一個(gè)果蠅Chd蛋白DroVav被認(rèn)為是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與酪氨酸磷酸化的表皮生長(zhǎng)因子受體(Dekeletal.,2000)。棉鈴蟲(chóng)HelicoverpaarmigeraChd64同源蛋白HaCal響應(yīng)20E誘導(dǎo)后以磷酸化形式進(jìn)入細(xì)胞核，受JH analog methoprene(JHA)誘導(dǎo)后以非磷酸化形式與USP1互作進(jìn)而參與調(diào)控20E或JH的信號(hào)級(jí)聯(lián)(Liuetal.,2011)

Chd64是一類含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白。CH結(jié)構(gòu)域一般含100～110個(gè)氨基酸殘基，它是一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，最初發(fā)現(xiàn)于鈣結(jié)合蛋白(Calponin)的氨基末端，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白中也存在CH結(jié)構(gòu)域(Gimonaetal.,2002;Ferjanietal.,2010)。根據(jù)蛋白序列的不同，含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要分為3類：氨基末端含單一CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、由兩個(gè)CH結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成絲狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(F-actin-binding domain,ABD)的蛋白質(zhì)及含兩個(gè)ABD結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(Korenbaum and Rivero,2002)。蛋白質(zhì)中兩個(gè)串聯(lián)的CH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，例如血影蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌養(yǎng)蛋白和纖維蛋白(Hartwigetal.,1994;McGoughetal.,1998)。研究認(rèn)為，大部分含CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都能與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合或者參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Banuelosetal.,1998)。果蠅中含CH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白DroVav作為一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器在果蠅發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Dekeletal.,2000)。Liu等發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲(chóng)中含CH結(jié)構(gòu)域的類肌鈣蛋白HaCal在20E和JH的通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)了相關(guān)基因的表達(dá)從而影響棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育(Fuetal.,2009;Liuetal.,2011)。在赤擬谷盜和蝦中，Chd64也在20E和JH調(diào)控的通路中發(fā)揮了重要作用(Sinetal.,2014;Tarczewskaetal.,2015)。

基于Chd64蛋白在果蠅和棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要作用，本論文克隆了鱗翅目模式昆蟲(chóng)同時(shí)也是重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)家蠶中與果蠅DmChd64同源的BmChd64基因，并對(duì)該蛋白氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)了該基因在家蠶中的時(shí)空表達(dá)，并利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行了該蛋白的亞細(xì)胞定位分析，以期豐富家蠶等全變態(tài)昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理的研究，為家蠶發(fā)育的人為調(diào)節(jié)與害蟲(chóng)的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

本研究選用的家蠶品系為大造，蠶卵由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供，家蠶幼蟲(chóng)定時(shí)以桑葉飼喂，于溫度26℃，相對(duì)濕度65%～75%，光周期L ∶D=12 ∶12條件下培養(yǎng)至成蟲(chóng)。大腸桿菌DH5α、BL21、原核表達(dá)載體pET-28a及真核表達(dá)載體pIE1-EGFP-N1均由本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol Isolate抽提試劑盒、pMD-18T載體、DNA限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker、DNA marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自TAKARA公司；質(zhì)粒提取和DNA膠回收試劑盒為T(mén)ianGen產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭粚?shí)驗(yàn)涉及的引物合成和相關(guān)DNA測(cè)序委托華大基因公司完成。

本研究所用BmN細(xì)胞株來(lái)源于家蠶卵巢細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與保存，細(xì)胞培養(yǎng)條件為27℃恒溫，所用培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的Grace培養(yǎng)基(GIBCO，USA)。細(xì)胞每隔3 d以1 ∶3的比例稀釋培養(yǎng)基作繼代培養(yǎng)。后均勻鋪板于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 家蠶總RNA的提取與cDNA合成

選取處于5齡游走期的家蠶，脂肪體、中腸、表皮和翅原基組織；取5齡至蛹期的家蠶，隔天取翅原基組織，并于液氮中速凍后研磨。按Trizol Isolate抽提試劑盒的說(shuō)明提取家蠶組織的RNA，用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度和濃度及質(zhì)量，然后按照TAKARA公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)說(shuō)明書(shū)，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 家蠶 BmChd64基因的克隆及序列分析

以果蠅中的DmChd64(Acession No:AAF47840)為參照基因，在NCBI上通過(guò)Blast分析對(duì)比出家蠶中對(duì)應(yīng)的同源基因，即BmChd64(Accesion No：NP_001040372；相似性：81%；E-value：4e-109)。根據(jù)序列設(shè)計(jì)PCR引物(見(jiàn)表1)，以家蠶cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。參照DNA膠回收試劑盒的方法進(jìn)行膠回收。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌體中，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。使用DNAstar軟件中的Clustal Alignment Programe對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行比對(duì)鑒定?；蛐蛄斜容^與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用DNAStar軟件的Clustal W方法。

表1 本研究所使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 家蠶BmChd64的原核表達(dá)和純化

用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)目的DNA片段和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為質(zhì)粒10 μL，BamH I酶1 μL，XhoⅠ酶1 μL，10 × K Buffer 3 μL，ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件為37℃ 3 h。膠回收后將二者連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-BmChd64，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌體中，加入最終濃度為1 M IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。為了確定重組蛋白是否以可溶的形式表達(dá)，收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體后，將菌體進(jìn)行超聲破碎，分別收集沉淀和上清液，在12%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。蛋白純化按照Ni-NTA His·Bind Resin(Novagen)試劑盒的方法進(jìn)行。取1 mL Ni2+柱于管中，使用2倍體積蒸餾水洗2次，2倍體積1×Charge (50 mM NiSO4)緩沖液洗3次，2倍體積1×Binding buffer(0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM Imidazole，pH7.9)緩沖液洗2次，將收集的上清液用0.45 μM的濾膜過(guò)濾后加入管中，分別以10倍體積的1×Binding buffer、6倍體積的1×Washing buffer (0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，60 mM Imidazole，pH7.9)和6倍體積的1×Elute buffer (0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，1 M Imidazole，pH7.9)洗柱子，離心收集上清，該上清含純化蛋白。用SDS-PAGE檢查蛋白純化效果。

1.5 BmChd64在家蠶不同發(fā)育時(shí)期各組織中的表達(dá)分析

以家蠶各發(fā)育時(shí)期翅原基cDNA和5齡游走期翅原基、表皮、脂肪體和中腸組織cDNA為模版，以家蠶Rp49(Gene ID:778453)作為內(nèi)參基因，參照qRT-PCR試劑盒的方法(TAKARA，大連)，采用20 μL體系，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各0.8 μL，6.8 μL ddH2O，2 μL DNA模板。使用7300 Real-time PCR System進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：95℃變性30 s，40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95℃ 3 s，60℃ 30 s。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3次，檢測(cè)BmChd64的表達(dá)。為增加數(shù)據(jù)的可比性，需提前檢測(cè)目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率是否一致。然后采用2法來(lái)確定每一個(gè)目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)標(biāo)基因Rp49的相對(duì)表達(dá)量。用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用ANOVA(多個(gè)處理間的兩兩比較)或獨(dú)立樣本T測(cè)驗(yàn)(兩個(gè)樣品間比較)來(lái)進(jìn)行處理間的差異比較分析。

1.6 BmChd64的亞細(xì)胞定位

將PCR擴(kuò)增得到的BmChd64的ORF片段插入到pMD18-T中，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后，將目的DNA片段插入到真核表達(dá)載體pIE1-EGFP-N1上，并通過(guò)雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pIE1-BmChd64-EGFP。

轉(zhuǎn)染前一天，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BmN細(xì)胞過(guò)夜，至細(xì)胞密度80%～95%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，去除細(xì)胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基，用無(wú)血清(FBS)的Grace’s Insect培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，再加入適量的無(wú)FBS的Grace’s Insect培養(yǎng)基到培養(yǎng)皿中，然后加入200 μL轉(zhuǎn)染混合物，輕輕混勻，培養(yǎng)8 h后，更換含10% FBS的Grace’s Insect培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察帶有GFP標(biāo)簽的BmChd64，進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmChd64基因克隆與序列分析

以家蠶cDNA為模版，對(duì)BmChd64基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分離后在500～700 bp中間處顯示出一條特異性條帶(圖1)。對(duì)該特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后與pMD18-T載體連接，通過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆細(xì)胞的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該P(yáng)CR產(chǎn)物與GenBank的相應(yīng)序列相同。

圖1 BmChd64基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of BmChd64 gene注：M，5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，BmChd64基因的PCR擴(kuò)增。Note:M,DL5000 DNA marker;1,PCR amplification of BmChd64 gene.

對(duì)克隆得到的BmChd64的cDNA序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)的堿基數(shù)為567 bp，編碼188個(gè)氨基酸。BmChd64蛋白的分子量大小為20.9 kDa，理論等電點(diǎn)為8.41。該基因所編碼的蛋白在第27～130個(gè)氨基酸處存在CH結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 BmChd64核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BmChd64注：陰影序列顯示CH域。下劃線，5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)；紅色字體，起始密碼子與終止密碼子；***，翻譯終止位點(diǎn)；黃色底紋，CH結(jié)構(gòu)域。Note:Shadow sequence showed a CH domain.Underline,5′ untranslated region and 3′ untranslated region;Red font,Start codon and stop codon;***,Translation termination site;Yellow shading,CH domain.

2.2 BmChd64的同源性比對(duì)與進(jìn)化分析

為了解Chd64蛋白在昆蟲(chóng)中的功能是否保守，將家蠶BmChd64的氨基酸序列與埃及伊蚊Aedesaegypti、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera、體虱Pediculushumanuscorporis、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、黑腹果蠅D.melanogaster、果蠅D.mojavensis及豌豆蚜Acyrthosiphonpisum進(jìn)行同源序列比對(duì)和相似性分析。結(jié)果顯示，BmChd64與其它昆蟲(chóng)的同源氨基酸序列具有極高的相似性，其中，與赤擬谷盜的相似性最高為84%，與DmChd64的相似性為80.9%。不同昆蟲(chóng)間同源氨基酸序列的高相似性(圖3和表2)，暗示了該基因在不同昆蟲(chóng)中的功能較保守，推測(cè)其在昆蟲(chóng)中可能發(fā)揮相似的功能?；谕葱詷?gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，BmChd64與鞘翅目赤擬谷盜的親緣關(guān)系最近，但與同為鱗翅目的棉鈴蟲(chóng)的HaCal親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

圖3 不同昆蟲(chóng)的Chd64蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of Chd64 protein from different insects注：Chd64蛋白來(lái)源及GenBank登錄號(hào)。1，家蠶 Bombyx mori transgenlin (Chd64) protein，NP_001040372.1；2，赤擬谷盜 Tribolium castaneum，XP_975100.1；3，埃及伊蚊 Aedes aegypti，XP_001652323.1；4，果蠅 Drosophila mojavensis，XP_015015904.1；5，黑腹果蠅 Drosophila melanogaster Cdh64，NP_001261398.1；6，岡比亞按蚊 Anopheles gambiae，XP_321834.4；7，豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum calpoin-like，NP_001191867.1；8，體虱 Pediculus humanus corporis，XP_002426427.1；9，棉鈴蟲(chóng) Helicoverpa armigera calpoin，XP_021189834.1。

表2 不同昆蟲(chóng)Chd64蛋白的氨基酸序列相似性(相似度(%))Table 2 Amino acid sequence identity of Chd64 protein from different insects(Identity)

圖4 BmChd64與其它昆蟲(chóng)同源氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Chd64 protein from different insects

2.3 BmChd64重組蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-BmChd64轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，在37℃，200 rpm的培養(yǎng)條件下，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a菌體蛋白作為對(duì)照。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在約26 kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖5-A，泳道2)，因pET-28a含有2個(gè)His標(biāo)簽，每個(gè)標(biāo)簽蛋白為3 kDa，預(yù)測(cè)BmChd64蛋白的分子量為 20.9 kDa，出現(xiàn)的目的條帶與預(yù)測(cè)的pET-28a-BmChd64蛋白大小相近，這表明BmChd64重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)。將菌體經(jīng)過(guò)超聲波破碎后，在上清和沉淀中都檢測(cè)到重組蛋白(圖5-A，泳道3和4)，表明重組蛋白以可溶的形式表達(dá)。蛋白純化后，在小于29 kDa處出現(xiàn)純化的特異性蛋白條帶，與預(yù)測(cè)的pET-28a-BmChd64蛋白約26 kDa大小一致(圖5-B，泳道1和2)。

圖5 BmChd64重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression of BmChd64 protein注：A，BmChd64重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a菌體蛋白；2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組總蛋白；3，誘導(dǎo)的菌體重組蛋白上清；4，誘導(dǎo)的菌體重組蛋白沉淀。B，BmChd64重組蛋白純化；M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2，純化后BmChd64重組蛋白。Note:A,Induced expression of BmChd64 recombinant protein;M,Standard protein maker;1,pET-28a bacterial protein induced by IPTG;2,Recombinant total protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG;3,Supernatant recombinant protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG;4,Precipitate recombinant protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG.B,Purification of BmChd64 recombinant protein;M,Standard protein maker;1 and 2,BmChd64 recombinant protein after purification.

2.4 BmChd64在家蠶各發(fā)育時(shí)期各組織中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR分別分析了家蠶5齡游走期脂肪體、中腸、表皮和翅原基中BmChd64的表達(dá)量和5齡至蛹期的翅原基中BmChd64基因的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，BmChd64在家蠶5齡游走期的各組織都有一定量的表達(dá)，BmChd64在脂肪體中的表達(dá)量最低，在翅原基中的表達(dá)量最高，其次是表皮和中腸(圖6)，BmChd64在翅原基的高表達(dá)暗示其與變態(tài)發(fā)育中翅原基的發(fā)育相關(guān)。在翅原基中，BmChd64在5齡末期和游走期都有較高水平的表達(dá)，在蛹初期表達(dá)下降，到蛹期 4 d表達(dá)又升高，至蛹末期表達(dá)量最高(圖7)。BmChd64在翅原基的表達(dá)模式與家蠶體內(nèi)20E的滴度變化高度一致(楊鑫華,2010;Wangetal.,2018)，暗示其在翅原基的表達(dá)可能與20E有關(guān)。

圖6 qRT-PCR檢測(cè)BmChd64在脂肪體、中腸、表皮和翅原基中的表達(dá)Fig.6 qRT-PCR analysis of expression profiles of BmChd64 in the fatbody,midgut,epidermis and wing disc注：EP，表皮；MG，中腸；FB，脂肪體；WD，翅原基。不同字母表示兩者之間顯著差異，P<0.05。Note:EP,Epidermis;MG,Midgut;FB,Fat body;WD,Wing disc.Different letters indicated significant differences,P<0.05.

圖7 qRT-PCR檢測(cè)BmChd64在翅原基中的表達(dá)Fig.7 qRT-PCR analysis of expression profile of BmChd64 in the wing disc注：L，幼蟲(chóng)期；D，天；W，游走期；PP，預(yù)蛹期；P，蛹期。數(shù)字表示在相應(yīng)時(shí)期的天數(shù)。不同字母表示兩者之間顯著差異，P<0.05。Note:L,Larval stage;D,Day;W,Wandering;PP,Prepupal stage;P,Pupal stage.The numbers indicated the days in the corresponding stages.Different letters indicated significant differences,P<0.05.

2.6 BmChd64蛋白的亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，通過(guò)了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息，可為探究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能提供線索。為檢測(cè)BmChd64在細(xì)胞內(nèi)的定位，本論文構(gòu)建了綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的BmChd64蛋白表達(dá)載體，通過(guò)雙酶切驗(yàn)證pIE1-BmChd64-EGFP載體構(gòu)建成功。用構(gòu)建好的pIE1-BmChd64-EGFP轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞株，并通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了EGFP載體的細(xì)胞中，熒光信號(hào)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均勻分布，且細(xì)胞質(zhì)比細(xì)胞核的綠色熒光更強(qiáng)。在轉(zhuǎn)染了BmChd64-pEGFP載體的細(xì)胞中，熒光信號(hào)雖在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，但圍繞細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的熒光明顯更暗，出現(xiàn)一個(gè)暗圈，而細(xì)胞核中熒光信號(hào)更強(qiáng)(圖8-D,F)，暗示了細(xì)胞質(zhì)中的BmChd64蛋白也可能入核，其主要是在細(xì)胞核中起作用。

圖8 BmChd64在BmN細(xì)胞中的定位Fig.8 Localization of BmChd64 in BmN cells注：A，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后綠色熒光圖像；B，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后白光圖像；C，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后熒光和白光Merge圖像；D，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后綠色熒光圖像；E，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后白光圖像；F，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后熒光和白光Merge圖像；N，細(xì)胞核；C，細(xì)胞質(zhì)；綠色熒光，目的蛋白存在的位置。Note:A,Green fluorescence image after transfection of EGFP vector in BmN cells;B,White light image after transfection of EGFP vector in BmN cells;C,Fluorescence and white light Merge image after transfection of EGFP vector in BmN cells;D,Green fluorescence image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;E,White light image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;F,Fluorescence and white light Merge image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;N,Nuclei;C,Cytoplasm.The fluorescence presented the location of target gene.

3 結(jié)論與討論

本研究成功克隆了家蠶的BmChd64基因，該基因cDNA的開(kāi)放閱讀框?yàn)?67 bp，編碼188個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為20.9 kDa，理論等電點(diǎn)為8.41，存在單個(gè)CH結(jié)構(gòu)域，與其它昆蟲(chóng)中已報(bào)道的Chd64蛋白含CH結(jié)構(gòu)域一致(Lietal.,2007;Liuetal.,2011;Kozowskaetal.,2014;Tarczewskaetal.,2015)。同源性比對(duì)表明該基因編碼的氨基酸序列與赤擬谷盜TcChd64和果蠅DmChd64同源性較高，推測(cè)BmChd64與TcChd64和DmChd64的功能相似。DmChd64的生物學(xué)功能已有研究證實(shí)，其通過(guò)與EcR/USP和Met等蛋白結(jié)合，共同調(diào)控JH應(yīng)答基因的表達(dá)，在介導(dǎo)果蠅JH和20E激素信號(hào)交流過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Lietal.,2007)。赤擬谷盜TcChd64蛋白的功能尚未有報(bào)道，Kozowska等對(duì)TcChd64蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其與DmChd64的相似性達(dá)74%，推測(cè)其與DmChd64的功能相似(Kozowskaetal.,2014)。因此，本研究推測(cè)，BmChd64可能與DmChd64一樣，參與了家蠶JH和20E的激素調(diào)控過(guò)程。

同時(shí)，本研究利用qRT-PCR檢測(cè)了BmChd64在家蠶不同組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，BmChd64在5齡游走期的多個(gè)組織都有一定量的表達(dá)，其中BmChd64在翅原基中表達(dá)量最高，其次是表皮和中腸，表達(dá)量最低的是脂肪體，該基因在翅原基中表達(dá)量最高，表明該基因在翅原基的發(fā)育過(guò)程中有著重要的作用。在翅原基中，BmChd64在 5齡中后期的表達(dá)水平較低，而到了5齡末期和游走期表達(dá)水平較高，在蛹初期表達(dá)下降，到蛹期4 d表達(dá)又升高，至蛹末期表達(dá)量最高，這一變化趨勢(shì)與20E在家蠶體內(nèi)的滴度變化(楊鑫華,2010;Wangetal.,2018)趨勢(shì)相吻合。在棉鈴蟲(chóng)中，20E誘導(dǎo)HaCal的快速磷酸化，HaCal可通過(guò)20E或JH信號(hào)迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與USP1相互作用，同時(shí)HaCalRNAi可以抑制20E對(duì)USP1、PKC和HR3的誘導(dǎo)(Liuetal.,2011)。因此推測(cè)，BmChd64可能在20E的作用下大量表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致翅原基完成幼蟲(chóng)-蛹期的變態(tài)發(fā)育并促進(jìn)5齡中后期的蛹翅向成蟲(chóng)翅轉(zhuǎn)變。

研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于更好地了解目的蛋白的作用機(jī)理和調(diào)控機(jī)制。本研究用構(gòu)建好的BmChd64-EGFP轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞株后通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)，熒光信號(hào)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，但主要是分布在細(xì)胞核中。Liu等發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲(chóng)中，含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白HaCal磷酸化能迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與核內(nèi)蛻皮激素受體復(fù)合物EcR-USP結(jié)合，從而在20E和JH的通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用(Liuetal.,2011)。因此推測(cè)家蠶BmChd64蛋白可能也與HaCal一樣會(huì)被磷酸化，而磷酸化影響了蛋白的亞細(xì)胞定位。Kozowska等利用Kratky圖表明果蠅DmChd64和赤擬谷盜TcChd64蛋白很可能在兩個(gè)末端都有內(nèi)在的無(wú)序區(qū)域(intrinsically disordered regions,IDRs)，這些區(qū)域可作為與各種因子進(jìn)行多重相互作用的平臺(tái)，并為其調(diào)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)(Kozowskaetal.,2014)。BmChd64與DmChd64、TcChd64同源性最高，推測(cè)家蠶BmChd64蛋白可能也可與其它因子互作，而與其它因子的互作也會(huì)影響B(tài)mChd64的亞細(xì)胞定位。綜上所述，家蠶BmChd64可能在20E的作用下參與調(diào)控家蠶翅原基的變態(tài)發(fā)育。