郝蘭蘭，馬乃膺，張仲興，李小蘭，王 鴻,2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070)

鋅指蛋白(zinc-finger proteins，ZFPs)是含有通過(guò)結(jié)合Zn2+而存在的一類具有指狀結(jié)構(gòu)的模體，它對(duì)植物基因的表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和植物逆境生理調(diào)節(jié)等都具有重要意義[1]。按照半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)的位置和數(shù)量可將鋅指蛋白分為C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6 和C8 等10 種不同類型[2-3]。C2H2 型鋅指蛋白由2 個(gè)Cys 和2 個(gè)His 殘基圍繞1 個(gè)Zn2+組成，構(gòu)成了一種獨(dú)特的三維空間結(jié)構(gòu)，包括1 個(gè)反向互補(bǔ)的β 折疊結(jié)構(gòu)和1 個(gè)α 螺旋結(jié)構(gòu)[4-5]。Q 型C2H2-ZFPs 作為重要的C2H2 型鋅指蛋白，廣泛分布于真核生物中，其鋅指結(jié)構(gòu)域(CX2-4CX3FX3QALGGHX3-5H)內(nèi)含有高度保守的QALGGH 基序，為植物所特有[6-9]。目前，已有多個(gè)物種Q 型C2H2-ZFPs 的相關(guān)研究，且在擬南芥[10]、楊樹[11]、水稻[12]和小麥[13]中其均被證明參與多種生物過(guò)程，包括植物生長(zhǎng)和器官發(fā)育以及對(duì)逆境的反應(yīng)與防御[14]。Q 型C2H2 型鋅指蛋白在低溫脅迫中也發(fā)揮著重要作用。OsMSR15在水稻受低溫和干旱脅迫時(shí)上調(diào)，其過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)水稻對(duì)逆境的耐受性[15]；ZHANG 等[16]研究表明：SICZFP1基因過(guò)表達(dá)能明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的耐低溫性；分離自大豆cDNA 文庫(kù)的C2H2 型鋅指蛋白基因SCOF-1已被證實(shí)與大豆的低溫耐受性密切相關(guān)，并可被低溫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，其編碼產(chǎn)物與SGBF-1 蛋白相互作用，調(diào)控下游耐冷基因(cold regulated gene，COR)表達(dá)，以增強(qiáng)耐低溫能力[17]；此外，也有研究指出低溫條件下矮牽牛ZPT2-2 和ZPT2-3 的表達(dá)量均會(huì)明顯上升以應(yīng)對(duì)低溫脅迫[18-19]。可見，Q 型C2H2 鋅指蛋白在植物抵抗低溫脅迫中起重要作用，然而在桃中尚未有研究報(bào)道。

桃(Prunus persicaL.)是薔薇科重要落葉小喬木，因其肉質(zhì)鮮美和營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“壽桃”和“仙桃”的美稱。中國(guó)桃的主要種植區(qū)位于溫帶和亞熱帶，該區(qū)域易發(fā)生周期性凍害，嚴(yán)重限制其產(chǎn)量與品質(zhì)，因此，挖掘抗寒基因?qū)μ岣咛业哪偷蜏匦阅芫哂兄匾饬x。隨著桃全基因組數(shù)據(jù)[20]的公布，本研究初步鑒定了桃Q 型C2H2 鋅指蛋白家族成員并預(yù)測(cè)其部分功能，為進(jìn)一步研究桃C2H2基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

2021 年7 月下旬，在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃園采集12 枝粗細(xì)相近、長(zhǎng)短相同、朝北直立生長(zhǎng)的丁家壩李光桃(P.persica nectarina) 1 年生帶葉枝條。將枝條隨機(jī)分為4 組，用保鮮袋密封，于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)。在4 ℃處理0、2、6 和12 h 時(shí)隨機(jī)選取1 組枝條，采集葉片作為試驗(yàn)材料，每組3 個(gè)枝條分別作為3 個(gè)重復(fù)，立即用液氮冷凍，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族的鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)[21]下載擬南芥Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族的蛋白序列，以其作為模板構(gòu)建文庫(kù)，在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.rosaceae.org/)[22][Prunus persica Whole Genome Assembly v2.0 &Annotation v2.1 (v2.0.a1)] 進(jìn)行隱馬爾科夫模型(hidden markov model，HMM)和BLASTP 算法搜索，獲得桃C2H2候選基因。進(jìn)一步運(yùn)用Pfam (https://pfam.xfam.org/search)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件進(jìn)行篩選，去除其中不含Q 型C2H2 鋅指蛋白特定結(jié)構(gòu)域的基因，最終獲得桃C2H2 家族成員。

1.2.2 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族理化性質(zhì)和染色體定位分析

利用EXPaSy (http://web.expasy.org/computepi/)在線工具對(duì)桃Q 型C2H2 鋅指蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸大小和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用WoLFPSORT 網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)在線預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位狀況和二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)；利用TBtools 軟件測(cè)定桃Q 型C2H2 基因家族成員染色體分布，并進(jìn)行可視化；從桃基因組中提取C2H2 型鋅指蛋白家族全部成員的所在位置信息，利用MapGene2 軟件將其家族成員定位到桃染色體上。

1.2.3 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)分析

使用MEGA-X 軟件分析基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；通過(guò)MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測(cè)蛋白保守基序，motif 的最大預(yù)測(cè)參數(shù)設(shè)置為14；將桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員的進(jìn)化樹和保守基序利用TBtools 軟件合并并可視化。

1.2.4 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員順式作用元件分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因上游啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp 序列進(jìn)行順式作用元件分析，并將結(jié)果用TBtools 可視化。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

根據(jù)順式作用元件(含低溫響應(yīng)元件LTR)以及國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Q 型C2H2 家族成員在其他物種上的研究，選取16 個(gè)極有可能響應(yīng)低溫脅迫的該家族成員進(jìn)行熒光定量PCR 驗(yàn)證。在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成C2H2 鋅指蛋白家族基因特異性引物序列(表1)。cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)并參照說(shuō)明書進(jìn)行。采用SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，其中Actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族的鑒定和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

在桃基因組中鑒定Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員46 個(gè)，并按照其在染色體上的位置順序命名為PpC2H2-1(Prupe.1G034100)～PpC2H2-46(Prupe.8G228000)。桃Q 型C2H2 基因家族的蛋白理化性質(zhì)分析(表2)顯示：氨基酸數(shù)量介于155～607 之間，理論等電點(diǎn)(pI)介于4.70～9.57，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量介于17.118 7～65.857 11 ku。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)顯示：PpC2H2s基因主要分布于細(xì)胞核，僅有少數(shù)成員存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。

表2 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab.2 Physicochemical properties of Q-C2H2 zinc finger protein gene family proteins in peach

2.2 桃和擬南芥Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為研究桃和擬南芥Q 型C2H2 鋅指蛋白基因之間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)104 個(gè)Q 型C2H2 鋅指蛋白(擬南芥58 個(gè)和桃46 個(gè))的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果(圖1)顯示：根據(jù)序列相似性，可將PpC2H2 和ATs 的蛋白序列聚為16 個(gè)亞組(A～P)。PpC2H2s 在16 個(gè)亞組上均有分布，其中P 亞組分布最多，為7 個(gè)；D 和M 亞組包含成員數(shù)量最少，各含1 個(gè)。每1 個(gè)亞組中最少包含1 個(gè)擬南芥C2H2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員。

圖1 擬南芥 (AT) 和桃 (Pp) Q 型C2H2 進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Q-type C2H2 in Arabidopsis thaliana (AT) and peach (Pp)

2.3 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)及保守基序

由圖2a 可知：46 個(gè)PpC2H2 可聚為7 個(gè)亞族(Ⅰ～Ⅶ)。由圖2 b 可知：35 個(gè)成員無(wú)內(nèi)含子，6 個(gè)成員含1 個(gè)內(nèi)含子，5 個(gè)成員含有2 個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子；其中，亞族Ⅱ和Ⅲ中的成員均無(wú)內(nèi)含子，Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ亞族中均有2 個(gè)成員含內(nèi)含子，Ⅳ亞族中含有內(nèi)含子的成員分別為PpC2H2-39、PpC2H2-06 和PpC2H2-24。由C2H2 成員的保守基序(圖2c)及其中主要的2 個(gè)motif (圖3)可知：除PpC2H2-26 外，其余45 個(gè)成員均含有motif1，說(shuō)明motif1 為C2H2 蛋白的高度保守基序；且同一進(jìn)化支的保守基序具有相似性，可能具有相同的功能，而不同進(jìn)化支內(nèi)保守基序數(shù)量和類型差異較大，該結(jié)果進(jìn)一步支持了桃Q 型C2H2鋅指蛋白基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果。

圖2 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及motif 分析Fig.2 Evolutionary relationship,gene structure and motif analysis of Q-type C2H2 zinc finger protein gene family members in peach

圖3 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族主要保守基序Fig.3 Main conserved motif of Q-type C2H2 zinc finger protein gene family in peach

2.4 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件

由圖4 可知：桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族包含多種植物激素順式調(diào)控元件，如：脫落酸響應(yīng)元件 (ABRE)、水楊酸響應(yīng)元件 (TCA)和光響應(yīng)元件 (G-box)等，其中還具有低溫響應(yīng)元件(LTR)，猜測(cè)C2H2 型轉(zhuǎn)錄因子在桃抗低溫脅迫中起重要作用。

圖4 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白家族成員啟動(dòng)子上游2 000 bp 的部分重要順式作用元件Fig.4 Some important cis-acting elements in the upstream 2 000 bp sequences of peach Q-C2H2 zinc finger protein family member

2.5 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族的染色體定位

由圖5 可知：Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員不均勻地分布于桃的8 條染色體上，其中，分布于1 號(hào)和6 號(hào)染色體上的基因數(shù)量最多，各具有10 個(gè)基因；分布在4 號(hào)染色體上的基因數(shù)量最少，僅含有1 個(gè)基因。此外，共鑒定出9 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，其中在1、2、6、8 號(hào)染色體上有2 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，7 號(hào)染色體上有1 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因。

圖5 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因的染色體分布Fig.5 Chromosomal distribution of C2H2 zinc finger protein gene in peach

2.6 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族成員的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

qRT-PCR 分析結(jié)果(圖6)表明：4 ℃低溫誘導(dǎo)時(shí)，16 個(gè)基因均上調(diào)，但表達(dá)模式不同。PpC2H2-03、PpC2H2-05、PpC2H2-12、PpC2H2-14、PpC2H2-15、PpC2H2-17、PpC2H2-18、PpC2H2-21、PpC2H2-24、PpC2H2-27、PpC2H2-28、PpC2H2-43、PpC2H2-44和PpC2H2-45的表達(dá)量均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)整體呈升高的趨勢(shì)，在12 h 達(dá)到峰值；PpC2H2-30和PpC2H2-34在2 h 達(dá)到峰值，之后有所降低，但均顯著高于0 h。因此，推測(cè)C2H2 轉(zhuǎn)錄因子家族可能在桃抗寒過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

圖6 桃Q 型C2H2 鋅指蛋白基因在低溫脅迫下的表達(dá)Fig.6 Expression of Q-type C2H2 zinc finger protein gene in peach under low temperature stress

3 討論

Q 型C2H2 鋅指蛋白基因家族是目前研究最為詳盡的鋅指家族之一，生物學(xué)功能多樣[23-25]。它不僅能與DNA、RNA 相互作用，還可與蛋白結(jié)合[26]，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括葉的發(fā)生[27]、花器官發(fā)育[28]、種子萌發(fā)[29]、小穗發(fā)育[30]、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及非生物應(yīng)激反應(yīng)[31]。迄今為止，已從多個(gè)物種中鑒定出Q 型C2H2 鋅指轉(zhuǎn)錄因子，如矮牽牛[32]、擬南芥[10]、水稻[12]、楊樹[11]、番茄[33]、大豆[34]、馬鈴薯[35]和甘藍(lán)[28]等，但在桃中尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究從桃基因組中篩選得到46 個(gè)Q 型C2H2 成員，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析。蛋白質(zhì)理化特性決定亞細(xì)胞定位、配體結(jié)合和分子結(jié)構(gòu)等特性，這些特性往往與蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有關(guān)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)：Q 型C2H2 鋅指蛋白家族成員多為堿性蛋白，分子質(zhì)量介于17.12～65.86 ku。此外，大量研究表明：亞細(xì)胞定位是確定序列生物學(xué)功能的重要線索，特別是與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的序列[37]。本研究預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該家族成員主要存在于細(xì)胞核中，僅有少數(shù)分布于線粒體、液泡和葉綠體中，這與井建玲等[38]對(duì)木薯的研究結(jié)果一致。保守結(jié)構(gòu)域表明：每個(gè)成員最少包含1 個(gè)C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)域，其中包含1 個(gè)植物特異性QALGGH 基序，在C2H2 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列中起重要作用[39-40]。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明：該家族蛋白被聚為16 個(gè)亞組(A～P)，并且聚類在同一分支中的基因具有功能多樣性。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)：Q 型C2H2 鋅指蛋白不均勻地分布在桃的8 條染色體上，說(shuō)明C2H2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員發(fā)揮著廣泛的作用。

低溫是制約作物產(chǎn)量與品質(zhì)的重要逆境因子，據(jù)統(tǒng)計(jì)：全世界每年因低溫造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元[41]。轉(zhuǎn)錄因子能與啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件結(jié)合，激活低溫脅迫下響應(yīng)基因COR的表達(dá)，從而響應(yīng)逆境生理[42]。Q 型C2H2 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中且具有多種功能，已被研究報(bào)道響應(yīng)低溫脅迫，如：ZFP245 的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)水稻對(duì)低溫、干旱和氧化脅迫的耐受性[43]。本研究對(duì)Q 型C2H2 蛋白啟動(dòng)子上游2 000 bp 序列分析表明其存在低溫響應(yīng)元件(LTR)，推測(cè)該家族成員可能在桃應(yīng)對(duì)低溫脅迫中具有重要作用。此外，基因的表達(dá)模式可為了解其功能提供重要線索。qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)：低溫脅迫下，16 個(gè)Q 型C2H2 家族成員均顯著上調(diào)，進(jìn)一步暗示Q 型C2H2 可能參與桃響應(yīng)低溫脅迫。

4 結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)方法在桃中鑒定了46 個(gè)PpC2H2基因，可聚為16 個(gè)亞組，且不均勻地分布在桃的8 條染色體上。低溫脅迫下，16 個(gè)Q型C2H2 家族成員表達(dá)均為上調(diào)，且以PpC2H2-18最為顯著，提示Q 型C2H2 可能與桃抗低溫性相關(guān)，這為進(jìn)一步研究該家族成員對(duì)低溫脅迫的作用提供了參考依據(jù)。