管 嬌，楊嘉玲，鄒紅旭，翁玉仙，樊興榮，王麗華，保志娟

(云南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201)

重金屬脅迫是限制植物生長發(fā)育的不良條件之一。一般來說，種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長過程中的關(guān)鍵階段，由于一些防御機制還沒有完全形成，對重金屬更為敏感。已有研究表明：重金屬脅迫會抑制植物的種子萌發(fā)和幼苗生長[1-2]。煙草是中國重要的經(jīng)濟作物，極易吸收和富集Cd、Pb 和Cr 等重金屬，Cd 和Cr 脅迫下煙草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高和葉綠素含量均下降，根冠比變小，生長受到抑制[3-4]。因此，研究緩解重金屬對種子萌發(fā)的影響勢在必行。

添加外源物是緩解植物重金屬污染的有效手段之一。常用的外源物有礦質(zhì)元素(如K、Ca 和Zn)[5]、植物激素(如水楊酸和脫落酸)[6]以及氣體信號分子(如NO 和H2S)[7-8]等。由于自身的抗氧化性及其對金屬離子的強螯合和細胞膜穩(wěn)定作用[9]，酚類物質(zhì)也被應用于緩解逆境脅迫。早期研究表明：合生花根系多酚在緩解鉛毒害中發(fā)揮了重要作用[10]。近年來，有學者添加外源茶多酚以緩解植物重金屬脅迫和鹽脅迫[11]，還有學者添加麝香草酚提高植物的耐鹽性[12]，這些研究表明酚類物質(zhì)主要是通過提高植株抗氧化活性和清除活性氧以抵御逆境脅迫，但其機制還有待深入探討。

大麻(Cannabis sativaL.)是中國傳統(tǒng)經(jīng)濟作物之一，是一種高生物量、生長快、具有多用途和多功能的物種[13]。由于對重金屬的耐受性較高，工業(yè)大麻已成為修復土壤重金屬污染的植物之一[14]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是工業(yè)大麻花和葉器官內(nèi)特有的次生代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤和神經(jīng)保護等多種生物活性，已成為醫(yī)療和化妝品領(lǐng)域的研究熱點[15-16]。同其他酚類物質(zhì)一樣，CBD 在機體內(nèi)能夠通過多種方式應對氧化應激損傷，保護神經(jīng)細胞[17]，如上調(diào)金屬硫蛋白2 (Mt2)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鋅離子濃度或利用本身具有的強還原性直接清除活性氧(ROS)等[18]。目前，CBD 對植物生長發(fā)育和重金屬抗性影響的研究還鮮見報道，本研究以K326 和白肋煙鄂煙1 號為試驗材料，探討外源CBD 施用對Cd 和Cr 脅迫下煙草種子萌發(fā)和幼苗素質(zhì)的影響，以期拓展CBD 在農(nóng)業(yè)中的應用，為植物重金屬污染防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草品種為K326 和白肋煙鄂煙1 號，種子由玉溪中煙種子有限責任公司提供。選取飽滿的煙草裸種，在試驗前用20% NaClO 浸泡消毒10 min，蒸餾水反復沖洗5～10 遍，播種前用濾紙吸干種子表面的水分。

1.2 試驗方法

試驗于2021 年3—4 月在智能光照培養(yǎng)箱(GXZ 型，寧波東南儀器公司)中進行，通過預試驗確定抑制煙草種子的Cr6+、Cd2+和CBD 質(zhì)量濃度范圍，Cr6+脅迫質(zhì)量濃度設(shè)置為8 mg/L，Cd2+脅迫質(zhì)量濃度設(shè)置為30 mg/L，CBD 質(zhì)量濃度設(shè)置為0、1、5 和25 mg/L。CBD 對煙草種子和幼苗的影響設(shè)計為單因素試驗，各煙草品種共4 組處理；CBD 對重金屬脅迫煙草種子和幼苗的緩解作用設(shè)計為雙因素試驗，各重金屬脅迫下各煙草品種共4 組處理。

將已消毒的種子均勻放入直徑為10 cm 的培養(yǎng)皿中，內(nèi)鋪2 層無菌濾紙，濾紙用4 mL 相應處理液潤濕，每皿播種50 粒。處理液為相應質(zhì)量濃度的金屬離子與CBD 溶液的混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用，配制方法為：Cr6+和Cd2+分別用重鉻酸鉀(K2Cr2O7，分析純) 和二水乙酸鎘[(CH3COO)2Cd·2H2O，分析純)]配制為高質(zhì)量濃度溶液，之后取一定量用CBD 溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度；CBD溶液用含0.1%的二甲基亞砜和0.07%的吐溫-80混合溶液溶解CBD 粉末(純度99%，購自云南漢盟制藥有限公司)而成。以無CBD 處理為對照組(CK)，每個處理重復3 次。種子置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度26 ℃、光照12 h/黑暗12 h、光照強度3 000 lx)，每天添加0.5 mL 相應處理液以保持濾紙濕潤，培養(yǎng)至一定時間后備用。

1.3 測定項目與方法

以種皮裂開、胚根露出為種子萌發(fā)的標準，培養(yǎng)期間每天記錄種子萌發(fā)的數(shù)量，培養(yǎng)3 d 后統(tǒng)計種子的發(fā)芽勢；7 d 后每個培養(yǎng)皿隨機選取10 株幼苗用直尺測定根長和苗高，并統(tǒng)計煙草種子的發(fā)芽率；14 d 時統(tǒng)計死亡幼苗株數(shù)，之后每個培養(yǎng)皿取35 株測定幼苗的干質(zhì)量(105 ℃殺青，60 ℃烘干至恒質(zhì)量)。各指標的計算方法為：

發(fā)芽勢(GE)=3 d 內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率(GR)=7 d 內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗高；

幼芽毒害死亡率=14 d 時所有死亡的幼芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

式中：Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 Origin 2018 和 SPSS 25 軟件進行統(tǒng)計分析及差異顯著性檢驗。對不同處理的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常條件下施用CBD 對煙草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.1.1 對煙草種子萌發(fā)的影響

由表1 可知：正常條件下，除對照組外，2 種煙草種子的萌發(fā)均隨CBD 質(zhì)量濃度的增加而增加。25 mg/L CBD 處理時，K326 和鄂煙1 號種子的活力指數(shù)最高，分別比對照顯著提高11.59%和47.32%；施用CBD 后，K326 種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均低于對照，其中1 mg/L CBD 處理的各指標分別較對照顯著降低5.04%、2.78%和5.69%；而CBD 對鄂煙1 號的影響卻與之相反，高質(zhì)量濃度CBD 處理與對照差異顯著，其中發(fā)芽指數(shù)比對照顯著增加17.48%。

表1 大麻二酚(CBD)對煙草種子萌發(fā)指標的影響Tab.1 Effects of cannabidiol (CBD) on the germination of tobacco seed

2.1.2 對煙草幼苗生長的影響

由圖1 可知：正常條件下，施用CBD 對K326和鄂煙1 號幼苗的生長均有一定促進作用，但最佳的CBD 質(zhì)量濃度不一致。對K326 幼苗而言，5 mg/L CBD 處理的根長和干質(zhì)量最高，分別比對照顯著提高8.96%和26.17%；而25 mg/L CBD處理的芽長最長，較對照顯著增加14.85%。對鄂煙1 號而言，促幼苗生長效果最好的CBD 質(zhì)量濃度為25 mg/L，幼苗的根長、芽長和干質(zhì)量分別較對照顯著提高14.00%、25.00%和33.96%。

圖1 大麻二酚(CBD)對煙草幼苗生長相關(guān)指標的影響Fig.1 Effects of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings

2.2 施用CBD 對Cr 和Cd 脅迫下煙草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.2.1 對受脅迫煙草種子萌發(fā)的影響

結(jié)合表1 和表2 可知：在Cr、Cd 脅迫下，2 種煙草種子的萌發(fā)受到抑制，各指標均降低，其中鄂煙1 號下降較為明顯。施用CBD 對Cr、Cd 脅迫下煙草種子萌發(fā)指標均有促進作用，且除Cr 脅迫鄂煙1 號種子萌發(fā)指標隨CBD 質(zhì)量濃度增加而上升外，其他處理各指標均隨CBD 質(zhì)量濃度增加呈先上升后下降的趨勢。當CBD 質(zhì)量濃度為5 mg/L 時，煙草種子活力指數(shù)比單獨Cr 處理顯著提高49.18% (K326)和30.87% (鄂煙1 號)，煙草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別比單獨Cd 處理顯著提高7.56%、4.38%、8.11%、35.58% (K326)和19.52%、4.65%、25.81%、51.50% (鄂煙1 號)。

表2 大麻二酚(CBD)對Cr 和Cd 脅迫下煙草種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of cannabidiol (CBD) on the germination of tobacco seeds under Cr and Cd stress

2.2.2 對受脅迫煙草幼苗生長的影響

由圖2 和圖3 可知：在Cr、Cd 脅迫下，施用CBD 對2 個品種的煙草幼苗生長均有促進作用，且對幼苗生長的影響及最佳質(zhì)量濃度同種子萌發(fā)指標變化一致。Cr 脅迫下，隨著CBD 的質(zhì)量濃度的增加對K326 幼苗的生長呈先促進后抑制的作用，5 mg/L CBD 處理的K326 幼苗根長、芽長和干質(zhì)量最高，分別比Cr 處理提高96.88%、31.98%和22.72%；鄂煙1 號幼苗的根長、芽長和干質(zhì)量在25 mg/L CBD 時最高，分別比Cr 處理顯著提高223.53%、30.00%和24.39%。Cd脅迫下，K326 和鄂煙1 號幼苗生長指標均隨CBD質(zhì)量濃度增加呈先增后降的趨勢，均在5 mg/L CBD 處理下達到最大值，其中，K326 幼苗的根長和干質(zhì)量分別比對照顯著提高110.53%和79.24%，鄂煙1 號幼苗的根長和干質(zhì)量分別比對照顯著提高157.14% 和82.15%。

圖2 大麻二酚(CBD)對Cr 脅迫下煙草幼苗生長的影響Fig.2 Effect of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings under Cr stress

圖3 大麻二酚(CBD)對Cd 脅迫下煙草幼苗生長的影響Fig.3 Effect of cannabidiol (CBD) on the growth of tobacco seedlings under Cd stress

2.3 施用CBD 對Cr 和Cd 脅迫下煙草幼苗死亡率的影響

由圖4 可知：各質(zhì)量濃度CBD 均可顯著緩解Cd 和Cr 對煙草幼芽的毒害。Cr 脅迫下，隨著CBD 質(zhì)量濃度的增加，K326 幼苗死亡率先下降后上升，鄂煙1 號幼苗死亡率則逐步下降，5 和25 mg/L CBD 處理時K326和鄂煙1 號幼苗死亡率分別達到最低值，分別比單獨Cr 處理顯著降低67.73%和76.04%；Cd 脅迫下，K326 和鄂煙1 號幼苗的死亡率均隨CBD質(zhì)量濃度的增加而先降低后升高，緩解效果最佳的是5 mg/L CBD 處理，K326 和鄂煙1 號幼苗的死亡率分別比單獨Cd 處理顯著降低69.5%和47.05%。

圖4 大麻二酚(CBD)對Cr (a)和Cd (b)脅迫下煙草幼苗死亡率的影響Fig.4 Effect of cannabidiol (CBD) on the mortality of tobacco seedlings under Cr (a) and Cd (b) stress

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命進程的開始，也是植物生長和繁衍的重要途徑。本研究中，在無重金屬脅迫下，CBD 對K326 種子的萌發(fā)有輕微的抑制作用，但卻促進了鄂煙1 號種子萌發(fā)。CBD 對2 種煙草種子萌發(fā)作用的差異，表明它對種子萌發(fā)的影響可能與種子及其幼苗內(nèi)部同工酶、激素(細胞分裂素和生長素等)的種類及水平等自身特性有關(guān)[19]。低質(zhì)量濃度的CBD 可干擾K326 種子內(nèi)部物質(zhì)的代謝，抑制細胞分裂、伸長及膜滲透性等，阻礙種子萌發(fā)，因此表現(xiàn)出低質(zhì)量濃度對種子萌發(fā)具有抑制的作用；而隨著CBD 質(zhì)量濃度增加，其抗氧化活性增加，對種子的抑制作用下降?？赡苁芊N子成熟度的影響，本研究中鄂煙1 號種子出苗的整齊度和一致性較差，而CBD 的施入可打破種子休眠，加速種子萌發(fā)，提高出苗整齊度[20]，因此，隨CBD 質(zhì)量濃度的增加，其對鄂煙1 號的促進作用增強。此外，不同煙草種子表面結(jié)構(gòu)不同，CBD 在2 種不同種子表面的滲透能力差異也可能導致不同的變化規(guī)律。

重金屬脅迫會誘導植株體內(nèi)生成過量ROS，破壞種子及幼苗的抗氧化平衡，從而產(chǎn)生毒害[21]。目前普遍認為 CBD 的活性作用主要與其自由基清除及抑制炎癥因子釋放有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)：施用CBD 可以有效緩解Cd、Cr 脅迫對K326 和鄂煙1 號種子萌發(fā)及幼苗生長的損傷，可能是因為CBD 能清除重金屬導致的過量ROS，提高煙草種子及幼苗的抗氧化能力[23]。同時CBD 結(jié)構(gòu)中的酚羥基絡合了部分金屬離子，使重金屬的生物活性降低從而緩解重金屬對煙草幼苗的毒害。對同一煙草品種而言，CBD 對Cd 脅迫的緩解效果優(yōu)于Cr，這可能是不同金屬元素與CBD 的交互作用不同，且與工業(yè)大麻對Cd 的高富集性有一定的關(guān)系[13]。此外，在相同重金屬脅迫下，CBD 緩解2 種煙草種子萌發(fā)的最佳質(zhì)量濃度有差異，可能一是不同煙草類型和品種對重金屬的耐性不同[24]，二是不同基因型對所處環(huán)境的敏感程度不同，從而導致2 種煙草種子對CBD的響應不同。

根部是煙苗吸收Cr 和Cd 等重金屬離子的主要器官，故也是受重金屬脅迫最嚴重的部位[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：正常培養(yǎng)和重金屬脅迫下，均表現(xiàn)出CBD 對2 個品種煙草種子活力指數(shù)和幼苗根的促進作用較為明顯，這與王一峰等[26]的結(jié)論一致。這是因為種子在發(fā)芽過程中，胚根快速吸水伸長并最先突破種皮，使得根受重金屬脅迫以及接觸CBD 溶液在時間進程上大于和早于芽，因此根的變化比其他器官顯著；也可能是因為同一植物的不同組織或部位對CBD 的敏感程度有差異。種子活力即種子的健壯度，是種子的發(fā)芽率和出苗率、幼苗生長的潛勢、植株抗逆能力以及生產(chǎn)潛力的總和，是種子品質(zhì)的重要指標。施用CBD 使煙草種子的活力指數(shù)顯著提高，說明CBD 可以提高煙草種子的綜合素質(zhì)，但其機理還有待進一步探討。CBD 可以緩解重金屬脅迫對煙草種子及幼苗的毒害，但CBD 對不同植物、不同器官及在不同質(zhì)量濃度和不同重金屬脅迫下產(chǎn)生的作用也不同，在實際生產(chǎn)中應根據(jù)品種和不同脅迫選擇適宜的CBD 質(zhì)量濃度。

4 結(jié)論

(1) 正常條件施用CBD 可抑制K326 種子萌發(fā)，但可促進其幼苗生長發(fā)育；隨質(zhì)量濃度增加，CBD 對白肋煙鄂煙1 號種子萌發(fā)和幼苗生長的促進作用增強。

(2) 施用CBD 可有效緩解Cd 和Cr 脅迫對K326 和鄂煙1 號的毒害作用。CBD 在抗重金屬脅迫方面具有潛在的應用前景。