安雅雯，楊曉東，郭紹乾，高智雄，石彩霞，高愛武，王海榮

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

在中國飼料端完全禁抗以及因飼喂高精料頻發(fā)反芻動物營養(yǎng)代謝病的背景下，如何有效解決由禁抗所帶來的各種問題，并在高精飼糧條件下保持動物健康，是飼料行業(yè)和營養(yǎng)調(diào)控的重點問題。苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)作為一種中草藥添加劑，廣泛分布于中國西北和西亞等荒漠的濕潤地區(qū)[1]，其富含生物堿、多糖、類固醇和黃酮等多種營養(yǎng)成分[2-3]，其中，生物堿是主要的活性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)：苦豆子提取物可增強小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫，并起到明顯的抗炎作用[4]。李巨銀等[5]研究表明：復(fù)方氧化苦參堿—黃芪多糖高、中和低劑量組均能提高雞血清中IL-2 和IFN-γ 的質(zhì)量濃度，從而增強動物的體液免疫能力。尚智等[6]研究表明：苦參堿可抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及IL-2 釋放，也可抑制腹腔巨噬細(xì)胞釋放IL-1，以進(jìn)一步抑制自身免疫反應(yīng)。JIA 等[7]研究表明：苦豆子可顯著改善由葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，抑制IL-1β 以及TGF-β1 表達(dá)，上調(diào)IL-10 表達(dá)。牛曉珊等[8]給高脂血癥鵪鶉飼喂復(fù)方苦豆子后，降低了其血清中的MDA 含量，升高了SOD 活性，證明苦豆子具有一定的抗氧化功效?？梢?，苦豆子及其提取物具有抗炎、抗氧化并調(diào)節(jié)動物機體免疫的功能。與非反芻動物相比，反芻動物的瘤胃微生態(tài)環(huán)境和飼糧結(jié)構(gòu)存在差異。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：隨著飼糧精粗比的增加，添加微量苦豆子可增強蒙古羔羊的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力[9]，推測在高精飼糧條件下添加苦豆子飼喂育肥羔羊可有效減少炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)羔羊機體健康。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，探究高精料飼糧中添加不同劑量苦豆子對育肥羔羊血清免疫及抗氧化功能的影響，以期為苦豆子作為中草藥添加劑在反芻動物營養(yǎng)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼糧組成

本試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，選取32 只3 月齡健康、體質(zhì)量為(25.73±2.17) kg 的杜蒙雜交公羔統(tǒng)一進(jìn)行免疫和驅(qū)蟲，隨機分為4 組，每組8 只。其中，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；T1組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.1%苦豆子；T2組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.3%苦豆子；T3組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.5%苦豆子。試驗預(yù)試期15 d，正試期60 d。試驗飼糧設(shè)計參照中國羊常用飼料成分及營養(yǎng)價值(NY/T 816—2004)，飼糧配方及營養(yǎng)成分見表1?？喽棺觼碓醇笆褂梅椒ǎ菏惺?，粉碎過篩后以相應(yīng)添加比例拌入精補料中進(jìn)行飼喂，添加劑量根據(jù)課題組前期體外試驗[9]確定。通過酸性染料分光光度法測得苦豆子中總生物堿(主要活性物質(zhì))含量為5.75%，回收率達(dá)95.95%。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)牧場開展，試驗前將羊舍進(jìn)行徹底消毒，試驗期間，試驗羊只按組間體質(zhì)量差異不顯著原則隨機分到1.5 m×1 m×1 m 的鐵制羊籠中單籠飼養(yǎng)，羊籠安裝獨立食槽和飲水裝置，羊舍溫度和濕度分別保持在15～20 ℃和50%～60%，自然通風(fēng)。試驗羊只每天08：00 和18：00 各飼喂1 次，自由采食和飲水。羊舍定期打掃和消毒。

1.3 樣品采集與測定指標(biāo)

試驗期間每天記錄每只羊的采食量，在正式試驗后的第 0、30 和60 天晨飼前對試驗羊空腹稱量并于頸靜脈采血制備血清，-80 ℃冷凍保存待測。血清免疫細(xì)胞分子、免疫球蛋白、促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)測定；谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽、丙二醛、過氧化物歧化酶和一氧化氮的測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

試驗儀器：紫外分光光度計(型號：UV-1780，日本島津)和酶標(biāo)儀(型號：SYNERGY H11，美國BioTek)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用SAS 9.2 中的GLM 模型進(jìn)行方差分析；采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。試驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清免疫功能的影響

2.1.1 對血清免疫細(xì)胞分子的影響

由表2 可知：在高精飼糧中添加不同劑量苦豆子后，T1組第30 天血清中的CD3+水平顯著高于其他3 組(P＜0.05)；T2組第30 天血清中的CD4+水平顯著高于對照和T3組(P＜0.05)；T1和T2組第60 天血清中的CD4+水平極顯著高于對照組(P＜0.01)，CD4+/CD8+的比值顯著高于對照組(P＜0.05)；其他各指標(biāo)各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

表2 高精飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清免疫細(xì)胞分子的影響Tab.2 Effects of Sophora alopecuroides on the serum immune cell molecules of Dumont lamb pg/mL

2.1.2 對血清免疫球蛋白的影響

由表3 可知：在高精飼糧中添加不同劑量苦豆子后，T2和T3組第30 天血清中的IgA 質(zhì)量濃度顯著低于對照組(P＜0.05)；T2組第60 天血清中IgM 和IgG 的質(zhì)量濃度極顯著高于對照和T1組(P＜0.01)；其他各指標(biāo)各組間均無顯著差異(P＞0.05)。3 個試驗組第30 天血清中的IgA 質(zhì)量濃度極顯著高于第60 天血清(P＜0.01)；T1組第30 天血清中的IgG 質(zhì)量濃度也極顯著高于第60天血清(P＜0.01)；其余各指標(biāo)各組內(nèi)差異均不顯著(P＞0.05)。

2.1.3 對血清炎性細(xì)胞因子的影響

由表4 可知：在高精料飼糧中添加不同劑量苦豆子后，T1和T2組第60 天血清中的IL-6 質(zhì)量濃度極顯著低于對照組(P＜0.01)；T2和T3組第30 天血清中的TNF-α 質(zhì)量濃度顯著低于對照組(P＜0.05)；T2組第60 天血清中IL-10、IL-22和TGF-β 的質(zhì)量濃度均顯著或極顯著高于其他3 組(P＜0.05 或P＜0.01)；3 個試驗組第30 天血清中的IFN 質(zhì)量濃度顯著高于對照組(P＜0.05)；其他各指標(biāo)各組間差異不顯著(P＞0.05)。T2組第30 天血清中的TGF-β 質(zhì)量濃度顯著低于第60 天血清(P＜0.05)；而T3組第30 天血清中的IFN 質(zhì)量濃度則極顯著高于第60 天血清(P＜0.01)；其余各指標(biāo)各組內(nèi)差異不顯著(P＞0.05)。

表4 高精飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清炎性細(xì)胞因子的影響Tab.4 Effects of S.alopecuroides on the serum inflammatory cytokines of Dumont lamb pg/mL

2.2 飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5 可知：在高精飼糧中添加不同劑量苦豆子后，3 個試驗組第30 天血清中的SOD 活性極顯著高于對照組(P＜0.01)，且試驗天數(shù)增加到第60 天時，3 個試驗組血清中的SOD 活性仍顯著高于對照組(P＜0.05)，血清中MDA 的含量則呈現(xiàn)相反的變化趨勢；3 個試驗組第60 天血清中的NO 濃度極顯著低于對照組(P＜0.01)；其他各指標(biāo)各組間差異不顯著(P＞0.05)。T1組第30 天血清中的MDA 含量極顯著高于第60 天血清(P＜0.01)；T3組第30 天血清中的GSH-Px 質(zhì)量濃度顯著高于第60 天血清(P＜0.05)；其余各指標(biāo)各組內(nèi)差異不顯著(P＞0.05)。

表5 高精飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of S.alopecuroides on the serum antioxidant index of Dumont lamb

3 討論

在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶通常僅從飼糧成本及動物的增質(zhì)量效果考量飼料添加劑的優(yōu)劣，而生長性能則是最直觀的量化參數(shù)。有研究表明：中草藥添加劑能明顯促進(jìn)動物生長[10-11]；本課題組前期研究[12]也發(fā)現(xiàn)：高精料中添加微量苦豆子可提高羔羊第0～30 天的階段日增質(zhì)量，說明苦豆子能激發(fā)高精料下羔羊的生長潛力。血液指標(biāo)的代謝產(chǎn)物可反映動物機體全身或局部代謝變化和正常的生理功能，通過分析血清相關(guān)代謝產(chǎn)物，可快速評估動物機體的營養(yǎng)健康狀況。

3.1 高精飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清免疫功能的影響

CD3+免疫細(xì)胞分子僅存在于T 細(xì)胞膜表面并參與T 細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，CD4+和CD8+免疫細(xì)胞分子分布在輔助性T 細(xì)胞及細(xì)胞毒性T 細(xì)胞膜表面。當(dāng)動物機體出現(xiàn)炎癥時，可根據(jù)CD4+的數(shù)量快速啟動機體免疫系統(tǒng)抵御病原菌，因此，當(dāng)動物血清CD4+/CD8+的比值升高時，說明動物機體的免疫力增強。ZHOU 等[13]研究表明：經(jīng)2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)，結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸和外周血清中CD4+的數(shù)量明顯降低，口服苦豆子總生物堿后大鼠的CD4+數(shù)量反而升高，說明苦豆子總生物堿可有效改善由2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。朱國峰[14]研究表明：3%的苦豆籽粕可顯著提高35 日齡AA 肉雞血清中CD3+和CD4+的數(shù)量，說明苦豆籽粕可促進(jìn)血液中T 淋巴細(xì)胞增殖，有利于免疫細(xì)胞因子更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究中T1組第30 天血清中的CD3+數(shù)量顯著升高，T1和T2組第60 天血清中的CD4+數(shù)量極顯著升高，說明飼糧中添加0.1%和0.3%苦豆子可提高動物機體免疫功能，這與前人的研究結(jié)果一致。推測其原因可能是苦豆子中的多種活性成分能夠顯著提高動物的細(xì)胞免疫，從而有效緩解高精飼糧條件下羔羊的炎癥反應(yīng)，并維持動物健康生長。

免疫球蛋白在血液中的含量可以反映動物機體的免疫功能。IgG 具有結(jié)合病毒和清除抗原的作用，IgA 在動物組織局部黏膜免疫中起重要作用，IgM 是血液中主要的抗感染免疫分子。楊春雷等[15]在蛋雞飼糧中添加復(fù)合中草藥可不同程度地提高蛋雞血清中IgA、IgM 和IgG 的含量；JIN 等[16]研究也表明：經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的復(fù)方中草藥組斷奶仔豬血清中IgA 和IgM 的含量顯著升高；WANG 等[17]以益生菌和復(fù)方中草藥混合發(fā)酵的濃縮液飼喂?jié)晌鼽S牛的研究表明：中草藥對動物機體免疫功能具有明顯的促進(jìn)作用。本研究中，T2組第60 天血清中IgM 和IgG 的質(zhì)量濃度均顯著升高，但I(xiàn)gA 的含量卻顯著降低，且3 個試驗組IgA 的質(zhì)量濃度隨著試驗時間的增加呈現(xiàn)極顯著降低的變化趨勢，這與前人的研究結(jié)果不同。分析其原因可能是試驗組羔羊的黏膜免疫屏障在試驗第30 天時發(fā)揮主要作用，并促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白，進(jìn)而提高了羔羊血清中的IgA 質(zhì)量濃度；當(dāng)試驗進(jìn)行到第60 天時，羔羊機體的黏膜免疫將不再起主要作用，血清IgA的質(zhì)量濃度則又恢復(fù)到正常水平，其具體機理有待進(jìn)一步驗證。

IL-2 是評價機體免疫能力的重要指標(biāo)；IL-6 既能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，又能刺激肝臟產(chǎn)生急性期蛋白而促進(jìn)動物感染，IL-1 與IL-6 可協(xié)同促進(jìn)T 細(xì)胞增殖，而TNF-α 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成并分泌IL-1，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。王超等[18]研究表明：在小鼠飼糧中添加氧化苦參堿可明顯降低IL-1β 和IL-6 的表達(dá)量；YE等[19]研究表明：苦豆堿可抑制由脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α 表達(dá)；JIA 等[7]研究發(fā)現(xiàn)：苦豆子組可顯著下調(diào)IL-1β基因的表達(dá)，并證明苦豆子對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用；張曉松等[20]研究也發(fā)現(xiàn)：與大腸濕熱癥模型組相比，苦豆草組中IL-1β、IL-2、IL-6 和TNF-α 指標(biāo)均顯著降低，說明苦豆草可以緩解大腸濕熱癥大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)并對其有較好的治療效果。本研究中，試驗組羔羊血清中的IL-1 質(zhì)量濃度低于對照組，但I(xiàn)L-2 質(zhì)量濃度高于對照組，這與黃志堅等[21]的研究結(jié)果相似。有關(guān)促炎細(xì)胞因子的研究各異，推測可能是由于動物品種、添加劑量、活性成分及飼養(yǎng)管理等因素所致。此外，本研究條件下，T1和T2組第60 天血清中的IL-6 質(zhì)量濃度均極顯著降低，試驗組第30 天血清中的TNF-α 質(zhì)量濃度均低于對照組，可見，苦豆子可抑制某些炎癥因子的形成和釋放，從而降低促炎細(xì)胞因子的數(shù)量以提高羔羊的免疫功能，使羔羊機體的炎癥反應(yīng)得以緩解，其機理仍需進(jìn)一步研究。

IL-10 是一種抑炎因子，參與炎癥和免疫反應(yīng)；IL-22 是一種信號分子，當(dāng)動物機體發(fā)生炎癥或感染時，IL-22 會對組織發(fā)出預(yù)警；TGF-β不僅參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，而且對細(xì)胞的分化和免疫有重要的調(diào)節(jié)作用。SHOICHIRO 等[22]給小鼠灌服青黛發(fā)現(xiàn)：隨著灌服劑量的增加，IL-10 和IL-22 在淋巴細(xì)胞中的表達(dá)隨之增加，證明青黛可改善由葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。桑秀秀等[23]在肝臟受損的小鼠飼糧中添加氧化苦參堿，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高小鼠血清中IL-10 的表達(dá)量。本研究中，T2組第60 天血清中的IL-10和IL-22 質(zhì)量濃度顯著升高，說明在飼喂高精料導(dǎo)致瘤胃過酸的情況下，0.3%的苦豆子能促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞分泌抑炎細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用以提高其免疫功能，并緩解羔羊機體的炎癥反應(yīng)，其具體抗炎機制有待進(jìn)一步驗證。LIU等[24]研究發(fā)現(xiàn)：香附總皂甙可抑制抗原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠脾細(xì)胞TGF-β、IFN-γ、IL-22 和IL-6 的產(chǎn)生；CHEN 等[25]研究表明：茵梔黃呈劑量依賴抑制由葡萄球菌腸毒素B 誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ 和TNF-α。這2 種中草藥均可作為免疫抑制劑降低抗體免疫反應(yīng)，以達(dá)到治療免疫疾病的效果；但也有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可抑制IFNγ 和IL-17 的表達(dá)，從而增強小鼠系統(tǒng)性白色念珠菌的感染[26]。本研究中，試驗組第30 天血清中的IFN 質(zhì)量濃度顯著高于對照組，且T2組第60 天血清中的TGF-β 質(zhì)量濃度極顯著升高，這與和李巨銀等[5]和郭小會[27]的研究結(jié)果一致。說明試驗組動物體內(nèi)存在一定數(shù)量的抗炎細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫，有效緩解高精飼糧帶來的危害，從而使羔羊更好地生長，這可能與苦豆子中的活性物質(zhì)能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌一定數(shù)量的抗炎因子以提高羔羊機體的免疫修復(fù)功能有關(guān)。

3.2 高精飼糧中添加苦豆子對杜蒙羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

T-AOC 表示動物應(yīng)對外界氧化應(yīng)激的總體表現(xiàn)，SOD 是清除機體自由基的關(guān)鍵酶，MDA 含量體現(xiàn)機體細(xì)胞和組織的氧化水平，NO 是動物機體內(nèi)氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，GSH-Px 質(zhì)量濃度與機體清除自由基的能力呈正相關(guān)。HAO 等[28]研究表明：隨著育肥羔羊飼糧中黃芪粉的增加，其血清中T-AOC 和T-SOD 活性呈線性增加；當(dāng)黃芪粉的添加量達(dá)到10 g/kg 時，MDA 含量最低，由此證明10 g/kg 是其最適添加量。ZHANG 等[29]給熱應(yīng)激奶牛每天飼喂220 g 復(fù)方中草藥，增加了奶牛血清中T-AOC、SOD 和GSH-Px 的活性，顯著降低了MDA 含量。CHEN 等[30]研究發(fā)現(xiàn)：五味子和芍藥的提取物可提高哮喘小鼠血清中SOD和GSH-Px 的活性，從而提高抗氧化能力。郭坤[31]將中草藥與γ-氨基丁酸聯(lián)合使用添加到黃牛飼糧中發(fā)現(xiàn)：試驗組黃牛血清中的MDA 含量顯著低于對照組，明顯降低了黃牛血清中過氧化物的含量。本研究中，3 個試驗組第30 天和第60天血清中的SOD 活性均高于對照組，而血清中的MDA 和NO 含量則呈相反的變化趨勢，說明日糧中添加適量苦豆子可有效清除羔羊體內(nèi)的自由基和過氧化物，從而增強動物機體的抗氧化能力，這與前人的研究結(jié)果一致。然而，羔羊血清中T-AOC 活性和GSH-Px 質(zhì)量濃度在各組間無顯著差異，這可能與中草藥作用緩慢、添加劑量及羊只個體差異有關(guān)，其機理有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

高精料中適量添加苦豆子可提高羔羊的細(xì)胞免疫和體液免疫，緩解羔羊機體的炎癥反應(yīng)，對改善羔羊機體的免疫功能和抗氧化能力產(chǎn)生積極影響，且以0.1%～0.3%的添加劑量最優(yōu)。