谷麗嬌，黃麗鴿，盛 丹，范新陽，苗永旺

(云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201)

催乳素(prolactin，PRL)是一種蛋白類激素，其名稱最早來自于對家鴿的研究，研究發(fā)現(xiàn)家鴿的嗉囊乳是因催乳素刺激嗉囊上皮細胞增生引起的，隨后從兔腺垂體前葉分離提純得到催乳素[1]。催乳素與生長激素(growth hormone，GH)和胎盤催乳素(placental lactogen，PL)同屬于生長激素/催乳素基因家族[2]。哺乳動物PRL 的生物學功能主要與乳腺發(fā)育、啟動和維持泌乳及乳蛋白基因的表達有關，并對乳蛋白、乳糖和乳脂等乳成分的合成起主要調(diào)控作用，與產(chǎn)奶量和乳成分呈正相關[3]。在奶牛泌乳期間，PRL 發(fā)揮“能量遷移”作用，能調(diào)節(jié)機體將肝臟、肌肉和脂肪等組織的營養(yǎng)和能量優(yōu)先流向乳腺，用于乳脂和乳蛋白合成[4]。因此，PRL被列為與奶牛泌乳性狀密切相關的重要候選基因。

普通牛PRL基因定位于23 號染色體，包含5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，CDS 長690 bp，編碼229 個氨基酸，1～30 位氨基酸組成信號肽[5]。有研究報道：PRL基因與奶山羊乳腺上皮細胞中乳蛋白、乳脂和乳糖含量有關[6]。WALL 等[7]給牛連續(xù)3 周注射少量催乳素后產(chǎn)奶量增加，而給泌乳奶牛注射催乳素的抑制劑溴麥角隱亭可使產(chǎn)奶量下降[8]。杜挺媛等[9]對廣西水牛PRL基因進行克隆，其完整編碼區(qū)長690 bp，編碼229 個氨基酸，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)存在2 個核苷酸替換位點，分別為c.T430C 和c.T576G。袁峰等[10-11]在檳榔江水牛PRL基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)c.C109T 和c.G192A 兩個核苷酸替換位點。

隨著泌乳生物學研究逐漸深入，已有研究表明Janus 激酶-信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyci，mTOR)信號通路介導的生物學過程與乳蛋白合成密切相關[12-14]。德宏奶水牛是在云南省德宏州通過當?shù)氐潞晁Ｅc國外引進的摩拉水牛和尼里拉菲水牛雜交形成的高代雜交群體，具有較高的河流型水牛血統(tǒng)(≥75%)，是進行泌乳性狀研究的理想素材[15]。本研究以德宏奶水牛為研究對象，對水牛PRL基因進行分離鑒定、生物信息學以及泌乳期和非泌乳期的多組織差異表達分析，旨在揭示德宏奶水牛PRL基因的理化特性和生物學功能，為深入研究水牛PRL基因的功能及其參與的信號路徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用于基因分離鑒定的樣品采自云南省德宏州芒市。選取4 頭成年健康的雌性德宏奶水牛(約4 歲，第3 胎)，其中2 頭處于泌乳高峰期(產(chǎn)后約60 d)，2 頭處于干奶期(分娩前約60 d)。水牛屠宰后對心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、瘤胃、小腸、肌肉和乳腺等組織進行取樣，并立即保存在液氮中，直至進一步處理。所有組織樣品進行總RNA 的提取，用于基因分離和組織差異表達分析。所有取樣水牛的飼養(yǎng)條件一致。

1.2 總RNA 的提取和cDNA 的合成

使用RNAiso Plus 試劑盒(TaKaRa，中國大連)分離組織總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進行檢測，用紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測其濃度和純度。使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，中國大連)合成cDNA。

1.3 水牛PRL 基因CDS 克隆及鑒定

1.3.1 引物設計與合成

以NCBI 數(shù)據(jù)庫中水牛PRL基因的mRNA 序列(EF054878.1)為參考序列，設計用于擴增水牛PRL基因完整編碼區(qū)及用于該基因表達譜分析的引物 (F：TTCCTGGTGAAGTGTGTTTCT，R：AATGTGGGCTTAGCAGTTG，退火溫度58.8 ℃);以水牛ACTB基因序列(NM_001290932.1)設計用于半定量RT-PCR 的內(nèi)參基因引物 (F：TCTTGGTCACCTCGTCGTC，R：GGCGCGATGATCTTGAT，退火溫度60 ℃)。引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR 反應及條件

以乳腺組織cDNA 為模板進行PCR 擴增。RT-PCR 反應體系為10 μL，包括上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，2×EsTaqMaster Mix 5 μL(康為，中國北京)，模板cDNA 1 μL (50 ng/μL)和ddH2O 3.2 μL。PCR 擴增程序為: 95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s、58.8 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s (35 個循環(huán))，最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增效果好的PCR 產(chǎn)物進行雙向測序。

測序獲得的序列采用SeqMan 和EditSeq 軟件 (DNAStar Inc.，美國)進行序列核對并輸出。經(jīng)ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)識別確定開放閱讀框，獲得德宏奶水牛PRL基因CDS 序列；以該序列作為查詢序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 同源搜索，確定所獲得序列的基因?qū)傩浴?/p>

1.4 分子特征、進化關系和分子功能分析

為確定水牛PRL基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構特征，將其與其他9 個物種的同源區(qū)進行比較。?？莆锓N及鼠和人的PRL基因信息從NCBI 數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=) 下載的基因組注釋文件獲得，使用TBtools 中的GXF 功能修復PRL基因完整的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構，采用在線軟件Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/)對PRL基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構進行可視化。通過Megalign 輸出所有PRL 氨基酸序列的一致性。基于PRL 氨基酸序列，使用MEGA 7 軟件的最大似然法(JTT矩陣模型)構建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。將每個物種的PRL 序列提交到MEME (https://meme-suite.org/meme/) 網(wǎng)站進行保守基序的下載。將所有物種的PRL 序列導入NCBI 數(shù)據(jù)庫的 Web CD-Serach (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sructure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)工具進行保守結(jié)構域的分析。將系統(tǒng)發(fā)育樹、保守基序和保守結(jié)構域的結(jié)果輸入到TBtools 的Gene Structure View (Advance)工具進行結(jié)果可視化。本研究克隆獲得的德宏奶水牛PRL基因序列命名為Dehong Dairy buffalo (Dhd_buffalo)，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)具有完整CDS 的?？莆锓N主要轉(zhuǎn)錄本序列進行比較，網(wǎng)上序列信息見表1。

表1 PRL 基因序列來源Tab.1 Sequence source of PRL gene

利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)和 Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)分別預測PRL 蛋白的理化特征，包括疏水性、信號肽、跨膜區(qū)、理論分子量和等電點。利用在線軟件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html) 和 WISSMODEL (https://swissmodel.expasy.org/)同源建模方法分別對氨基酸的二級結(jié)構和三級結(jié)構進行預測。通過ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 和 Prosite Scan (http://prosite.expasy.org/prosite.html)預測亞細胞定位和氨基酸修飾。使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/seach/sequence-search)、Uniprot (http://www.uniprot.org/)和DAVID (http://david.ncifcrf.gov/)進行蛋白質(zhì)分子功能和生物學路徑分析。

1.5 水牛PRL 基因組織差異表達分析

采用半定量RT-PCR 方法，以水牛ACTB基因作為內(nèi)參 (內(nèi)參引物見1.3.1 節(jié))，檢測德宏奶水牛PRL基因在泌乳期和非泌乳期心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、瘤胃、小腸、肌肉和乳腺等11 個組織的表達量。PCR 反應體系和反應程序與1.3.2 節(jié)的基因克隆相同。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用Quantity One 軟件對組織表達譜檢測膠圖進行分析，得出相對表達量數(shù)據(jù)。基于該數(shù)據(jù)，采用Excel 軟件構建基因表達譜柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛PRL 的克隆與鑒定

本研究得到750 bp 的PCR 產(chǎn)物(圖1)，與預期結(jié)果相符。對獲得的序列進行開放閱讀框(ORF)識別，發(fā)現(xiàn)該序列的CDS 全長690 bp，編碼229 個氨基酸(圖2)。該CDS 序列與普通牛、野牛、牦牛、瘤牛、山羊、綿羊和藏羚羊PRL基因CDS 序列同源性均為99.6%，故確定所獲序列為德宏奶水牛PRL基因序列。序列分析表明：水牛PRLCDS 區(qū)序列的A、G、T 和C 堿基含量分別為25.07%、23.77%、23.33%和27.83%，G+C的含量為51.59%。

圖1 德宏奶水牛PRL 基因RT-PCR 產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR product of Dehong dairy buffalo PRL gene

圖2 本研究獲得的德宏奶水牛PRL 基因CDS 區(qū)序列及對應的氨基酸序列Fig.2 Complete CDS of Dehong dairy buffalo PRL gene and its encoded amino acid sequence in this study

2.2 分子特征、進化關系和分子功能

2.2.1PRL基因結(jié)構

由圖3 和表2 可知：在?？莆锓N中，每個牛科物種的PRL基因CDS 長度相同，外顯子2、外顯子3 和外顯子4 的長度相同，轉(zhuǎn)錄起始位點和終止位點的位置不相同，5′UTR 和3′UTR 的長度不同，外顯子1 和外顯子5 的長度也不同。所有?？莆锓N含有5 個外顯子和4 個內(nèi)含子。

圖3 PRL 基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構Fig.3 The structure of PRL transitional region

表2 水牛與其他物種PRL 結(jié)構信息Tab.2 Structural information of PRL in buffalo and other species

2.2.2 PRL 蛋白的理化特征

由表3 可知：德宏奶水牛PRL 蛋白與其他牛科物種PRL 的基本理化特征相似性較高。德宏奶水牛PRL 蛋白為親水的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預測表明：德宏奶水牛PRL 蛋白無跨膜結(jié)構，含有1 個位于N 端1～30 的信號肽，成熟肽由之后的199 個氨基酸殘基構成。

表3 PRL 蛋白基本理化特征Tab.3 Basic physicochemical characteristics of PRL protein

2.2.3 水牛PRL 功能修飾位點

對德宏奶水牛PRL 蛋白功能修飾位點進行預測，結(jié)果顯示：PRL 蛋白中潛在的功能修飾位點有5 種(表4)。

表4 水牛PRL 的功能修飾位點Tab.4 Function modification sites in buffalo PRL

2.2.4 基序、保守結(jié)構域和進化關系

由圖4 可知：水牛與其他?？莆锓N的PRL 氨基酸序列一致性達97.4%以上。

圖4 水牛與本研究其他9 個物種間PRL 的氨基酸序列一致性Fig.4 The consistency of PRL amino acid sequences between buffalo and other nine species in this study

對9 種哺乳動物的PRL 氨基酸序列基序和保守結(jié)構域進行分析，結(jié)果(圖5)顯示：?？莆锓N含有7 個基序，分別為motif1～motif7，人含有8 個基序，分別為motif1～motif5、motif7～motif9。水牛與其他?？莆锓N及人均含有1 個prolactin_like 保守結(jié)構域。?？莆锓N的prolactin_like 結(jié)構域(AA32～229)由motif1～motif4 和motif6～motif7組成，人的proactin_like 結(jié)構域(AA30～228)由motif1～motif4 和motif7～motif9 組成。水牛PRL 和其他?？莆锓N存在相同的基序和保守結(jié)構域，且每個牛科物種的結(jié)構域起始位置均為AA32～229，說明牛科物種PRL 蛋白之間功能相似。

圖5 水牛與本研究其他9 個物種 PRL 的系統(tǒng)發(fā)育樹、基序構成和保守結(jié)構域Fig.5 Phylogenetic tree,motif composition and conserved domain based on the PRL sequences of buffalo and other nine species in this study

基于PRL 氨基酸序列構建水牛及其他9 個物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖5)顯示：水牛與其他?？莆锓N聚在一起。

2.2.5 PRL 二級結(jié)構的構成和三級結(jié)構

德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白的二級結(jié)構的構成如圖6 所示。水牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折疊和無規(guī)卷曲含量分別為56.77%、1.75%、1.75%和39.74%，普通牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折疊和無規(guī)卷曲含量分別為59.39%、2.18%、3.06%和35.37%。德宏奶水牛和普通牛PRL 與模板大鼠PRL (3 npz.1.A)的序列一致性均為73.87%，覆蓋率均為87%，覆蓋區(qū)域也均為AA31～229，其保守結(jié)構域(AA32～229)完全在覆蓋區(qū)域，德宏奶水牛PRL 的三級結(jié)構與普通牛的極其相似(圖7)。

圖6 德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白二級結(jié)構單位構成預測Fig.6 Prediction of the secondary structure composition of PRL protein in Dehong dairy buffalo and cattle

圖7 德宏奶水牛和普通牛PRL 成熟肽的三級結(jié)構Fig.7 Tertiary structure of the mature peptide of Dehong dairy buffalo and cattle PRL

2.3 水牛PRL 的生物學過程和分子功能

預測表明：德宏奶水牛PRL 為分泌到細胞膜外的蛋白，屬于生長激素/催乳素家庭成員。其參與負調(diào)控細胞凋亡(GO：0001973)、肽激素分泌(GO：0030072)、正調(diào)控脂肪酸合成(GO：00457-23)和正向調(diào)節(jié)基因表達(GO：0010628)的生物學過程；其分子功能主要是激素激活(GO：00-05179)和與催乳素受體結(jié)合(GO：0005148)；其參與的路徑是細胞因子與細胞因子受體相互作用(GO：0007267)、神經(jīng)活性配體與受體相互作用、PI3K-Akt 信號通路(GO：0014068)、JAK-STAT信號通路(GO：0046427)和催乳素信號通路。

2.4 水牛PRL 組織差異表達分析

由圖8 可知：PRL基因在所檢測的2 個時期的11 個德宏奶水牛組織中均有表達。其中，PRL基因在非泌乳期的脾臟中表達量最高，其次是肝臟和肌肉；在泌乳期的乳腺中表達量較高。PRL基因在肺臟、乳腺、瘤胃、小腦和小腸中的表達表現(xiàn)為泌乳期高于非泌乳期；在脾臟、肝臟、心臟、大腦、肌肉和腎臟中的表達則相反。

圖8 德宏奶水牛PRL 基因組織差異表達Fig.8 Tissue differential expression of the PRL gene in Dehong dairy buffalo

3 討論

本研究對德宏奶水牛PRL基因進行了分離鑒定，確定其PRL基因CDS 序列長690 bp，編碼1 個由229 個氨基酸殘基構成的多肽。PRL 蛋白屬于生長激素/催乳素家族，本研究發(fā)現(xiàn)其含有1 個prolactin_like 結(jié)構域(AA32～229)。含有該結(jié)構域的蛋白主要功能為正調(diào)控動物泌乳。有研究表明：雞和斑馬魚的prolactin_like 是催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)的替代配體，prolactin_like 可以通過PRLR 在許多靶組織中發(fā)揮自分泌或旁分泌作用[17-18]。德宏奶水牛PRL基因的結(jié)構與其他?？莆锓N相似，其編碼蛋白的二級結(jié)構組成和三級結(jié)構與普通牛也有很高的相似性。PRL 蛋白的基序和保守結(jié)構域在?？莆锓N之間高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：德宏奶水牛與其他?？莆锓N聚為一類，揭示它們之間的PRL 功能更相似?；谒RL基因轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構、其編碼蛋白基序和保守結(jié)構域分析，揭示PRL 在水牛與其他?？莆锓N中的功能一致。

研究發(fā)現(xiàn)：乳蛋白合成的2 條主要信號通路為JAK-STAT 通路和磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(sphatidylinositol 3-kinase-AKT serine/threonine kinase-mammalian target of rapamyci，PI3K-AKT-mTOR)信號通路[19]。本研究預測顯示：PRL 參與了JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 信號通路。JAK2-STAT 信號通路是在催乳素作用下酪蛋白合成轉(zhuǎn)錄水平的重要途徑之一[20]。PRL 通過與PRLR 結(jié)合，啟動JAK-STAT信號途徑并激活反式作用因子STAT，使STAT作用于乳蛋白基因啟動子區(qū)的靶序列，啟動或增強乳蛋白相關基因的表達[21-22]。在牛乳腺組織中，PI3K-AKT-mTOR 信號通路控制著乳蛋白相關基因的翻譯。催乳素也可以調(diào)節(jié)PI3K-AKT 信號傳導途徑，添加催乳素后 PI3K 的p85 亞基、PRLR的p95 亞基及胰島素受體底物1 (insulin receptor substrate 1，IRS1)的p185 亞基的酪氨酸磷酸化增加，使PI3K 和IRS1 共同與PRLR結(jié)合，進而發(fā)揮其調(diào)節(jié)乳腺功能的作用[14]。本研究預測水牛PRL 蛋白正調(diào)控脂肪酸合成的生物學過程。研究表明：催乳素可極顯著提高牛乳腺組織中與脂質(zhì)合成相關基因的表達量[23]，與本研究的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)：PRL 能激活奶牛乳腺上皮細胞中的 JAK2-STAT5 信號通路，進而提高乳脂和乳蛋白的合成[24]。體外細胞實驗證實：在淋巴瘤細胞中添加PRL 可激活 PI3K-AKT 通路，被激活的AKT 能調(diào)節(jié)與蛋白和脂類代謝相關的轉(zhuǎn)錄因子活性，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和mTOR 等，進而參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成[25]。本研究揭示水牛PRL 蛋白與其他?？莆锓N的PRL 蛋白功能相似，推測水牛PRL 在JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 乳蛋白信號通路及乳脂合成過程中發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)成熟的必要步驟是翻譯后的修飾加工，而磷酸化修飾對蛋白的結(jié)構和功能具有重要作用，磷酸化修飾與細胞的信號轉(zhuǎn)導和細胞周期等過程相關[26]。酪氨酸激酶介導細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，參與PI3K-Akt 和JAK-STAT 通路，在細胞的代謝、分裂、分化、生物功能和死亡過程中起著重要作用[27]。酪蛋白激酶Ⅱ作為參與細胞信號轉(zhuǎn)導的重要分子，通過對底物的磷酸化作用而影響細胞增殖和分化、細胞信號的轉(zhuǎn)導和加工以及細胞凋亡[28]。N-肉豆蔻酰化位點是一種蛋白質(zhì)脂質(zhì)修飾位點，它在細胞信號傳導、蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)靶向內(nèi)膜和質(zhì)膜系統(tǒng)中起著重要作用[29]。本研究也預測到了這些修飾位點，但其在德宏奶水牛PRL 蛋白中的功能還有待研究。

研究表明：PRL在垂體、乳腺、淋巴、大腦、卵巢、腎臟和脾臟等組織中表達[30]。本研究所檢測的德宏奶水牛泌乳期和非泌乳期11 個組織中均有PRL表達，說明該基因在多種組織中發(fā)揮作用。在本研究中，PRL基因在小腸中的表達量表現(xiàn)為泌乳期高于非泌乳期。在大鼠哺乳期誘導小腸中PRL的升高可增加腸道對鈣的吸收，進而滿足胎兒生長和母鼠產(chǎn)奶的鈣需求[31]。還有研究報道：PRL基因在大鼠乳腺中表達，且持續(xù)整個泌乳期，在斷奶早期PRL基因的表達開始下降，乳腺上皮細胞開始退化[32]。體外培養(yǎng)乳腺上皮細胞的研究表明：添加催乳素可以促進β-酪蛋白基因表達及β-酪蛋白合成[33]。缺少PRL基因可導致產(chǎn)奶量持續(xù)降低，乳腺泌乳細胞數(shù)量可在48 h 內(nèi)減少20%～25%[34]。PRL在泌乳期乳腺中的表達量顯著高于非泌乳期，表明該基因在泌乳期乳腺組織中發(fā)揮重要作用。在泌乳期PRL 表達水平變化激活STAT5a 及其信號途徑，結(jié)果是降低奶牛乳腺上皮細胞凋亡并提高乳蛋白合成[35]。有研究顯示：用催乳素處理奶牛乳腺上皮細胞，在催乳素質(zhì)量濃度為200 μg/L 時能顯著提高AKT、mTOR、糖體蛋白S6 激酶1、真核細胞翻譯起始因子和β-酪蛋白的表達量[36]。PRL參與了JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 乳蛋白合成信號通路，推測德宏奶水牛PRL基因可能參與泌乳期乳腺上皮細胞中乳蛋白的合成。

4 結(jié)論

德宏奶水牛PRL基因CDS 長690 bp，編碼1 個由229 個氨基酸殘基構成的多肽，是含有1 個prolactin_like 結(jié)構域的膜外分泌蛋白。水牛PRL的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)構及其編碼蛋白的理化特征、結(jié)構和保守結(jié)構域與其他?？莆锓N的一致性很高，說明PRL 的功能在水牛與其他牛科物種間高度保守。水牛PRL 無跨膜結(jié)構，含有1 個信號肽，其作為胞外蛋白與PRLR 結(jié)合發(fā)揮作用。PRL在水牛包括乳腺在內(nèi)的多個組織中都有表達，推測該基因可能通過JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 信號通路參與德宏奶水牛的泌乳過程。