徐 丹 ,DJIMA Hassan Ali ,李瑞怡 ,李在均

(1.江南大學 化學與材料工程學院,無錫 214122;2.南京中醫(yī)藥大學 翰林學院,泰州 225300;3.江南大學 生命科學與健康工程學院,無錫 214122)

經常食用蔬菜會給人體健康帶來很多益處,比如增強人體免疫力,預防糖尿病、便秘、心血管疾病和結腸癌等[1],其中黃瓜是人們喜愛的蔬菜之一。在黃瓜種植過程中,為了有效地避免黃瓜被害蟲破壞,提高黃瓜的產量,廣泛使用了各種農藥,導致黃瓜中殘留大量農藥,進而對人類健康構成嚴重威脅,且對環(huán)境造成嚴重的破壞。因此,開發(fā)一種簡單、快速和靈敏度高的方法用于黃瓜中農藥殘留量的測定是非常有意義的。目前常用于農藥殘留檢測的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、拉曼光譜法、熒光光譜法以及電化學法[2-6]。采用色譜法以及光譜法時,需要昂貴的儀器、專業(yè)的人員以及繁瑣的樣品預處理步驟[7]。電化學適配體傳感器是通過敏感物質(適配體)來對不同濃度水平的靶標進行測定,并將對靶標的識別轉化為可檢測的物理信號[8],具有簡單、快速、靈敏度高、成本低、選擇性好以及可小型化等優(yōu)點[9],被廣泛用于農藥殘留的測定。而對于適配體傳感器的構建,電極材料對其性能的影響起到非常重要的作用。

近年來,石墨烯由于具有大的比表面積、良好的導電性以及較好的化學穩(wěn)定性,被廣泛用于電化學適配體傳感器的構建,是一種出色的傳感材料,如文獻[10]中通過氧化石墨烯構建了電化學適配體傳感器,用于甲胎蛋白的測定。然而石墨烯很容易通過π-π堆疊發(fā)生團聚,導致活性面積減小。為了解決這個問題,將石墨烯與金屬納米粒子結合,不僅可有效改善石墨烯片的團聚,增大活性面積,還可通過石墨烯與金屬納米粒子之間的協(xié)同作用有效地提高傳感器的性能。如文獻[11]通過氧化石墨烯與銀納米粒子結合形成的復合物構建適配體傳感器,用于地高辛的測定,氧化石墨烯與銀納米粒子之間的相互作用,極大提高了傳感器的性能;文獻[12]在羧基化的氧化石墨烯上電沉積金-鈀雙金屬納米粒子,構建的適配體傳感器用于MUC1蛋白測定,該復合材料極大提高了傳感器的性能,檢出限達到了0.79 fmol·m L－1。盡管通過石墨烯與金屬的結合可以改善傳感器的性能,但是常出現(xiàn)金屬納米粒子在石墨烯片上不均勻分布、部分團聚的現(xiàn)象,這極大地降低了傳感器的導電性。因此,制備金屬納米粒子在石墨烯片上均勻分散的復合材料是提高傳感器的關鍵。

本工作制備了銀銅雙金屬/組氨酸功能化石墨烯量子點(His-GQD)/石墨烯雜化物(AgCu/His-GQD/G),合成的雜化物提供了三維結構,且銀和銅納米粒子均勻地分散在石墨烯片上?；贏gCu/His-GQD/G 構建了電化學適配體傳感器,該方法成功地用于黃瓜中克百威、毒死蜱和多菌靈的測定,并表現(xiàn)出高的靈敏度和選擇性。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

S4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM);JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM);D8 Advance型X射線衍射(XRD)儀;CHI660D 型電化學工作站;In-Via型顯微共焦激光拉曼光譜儀。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖液(pH 7.4),包含0.1 mol·L－1NaCl、5.0 mmol·L－1KCl和5.0 mmol·L－1MgCl2;Tris-乙二胺 四乙酸(EDTA)緩沖液,包含10 mmol·L－1Tris-HCl和1 mmol·L－1EDTA。

毒死蜱標準溶液系列:稱取9.56 mg毒死蜱標準品置于燒杯中,用甲醇溶解,并轉移至50 mL 容量瓶中定容,搖勻。使用時,以水為溶劑,逐級稀釋至質量濃度分別為1.00×10－2,5.00×10－2,1.00×10－1,5.00×10－1,1.00,5.00,1.00×10,1.00×102,5.00×102,1.00×103pmol·L－1的毒死蜱標準溶液系列。

多菌靈適配體,5′-(NH2)-(CH2)6-GGGCACACAACAACCGATGGTCCAGCCACCCGAATGACCAGCCCACCCGCCACCCCGCG-3′;克百威適配體,5′-(NH2)-(CH2)6-CACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAAGAGAACACTGGGGCAG ATATGGGCCAGCAGGTC-3′;毒死蜱適配體,5′-(NH2)-(CH2)6-CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTAGGGTTACGCCTGCAGCGATTCTTGATCGCGCTGCTGGTAATCCTTC TTTAAGCTTGGCACCCGCATCGT-3′;毒死蜱標準品、克百威標準品、多菌靈標準品的純度均為98%、馬拉硫磷(MAL)、殺螟硫磷(BOR)、二嗪農(DIA)、辛硫磷(PHO)、西維因(CAR)、檸檬酸、組氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4,10 mmol·L－1)、Ag NO3、Cu(NO3)2·3H2O、殼聚糖、4-巰基己醇(MCH)均為分析純;試驗用水為二次蒸餾水。

黃瓜樣品購自某菜場。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 結構表征

采用SEM 觀察形貌,測試電壓為3 k V;采用TEM 觀察微觀結構,測試電壓為200 k V;采用XRD 分析結構,Cu 靶Kα射線,掃描范圍為5°～90°,掃描速率為2°·min－1;拉曼光譜測試采用In-Via型顯微共焦激光拉曼光譜儀。

1.2.2 電化學測定

電化學試驗在CHI660D 型電化學工作站三電極體系中進行,修飾后的玻碳電極(GCE)作為工作電極,銀/氯化銀電極作為參比電極,鉑絲作為對電極。所有試驗均在含 5 mmol · L－1[Fe(CN)6]3－/4－([Fe(CN)6]3－與[Fe(CN)6])4－的混合物)的PBS(pH 7.4)底液中測定。循環(huán)伏安法(CV)的掃描范圍－0.1～0.7 V,掃描速 率100 m V·s－1;電化學阻抗(EIS)在頻率1～100 k Hz,電位正弦波信號振幅±5 m V 條件下測定;差分脈沖伏安法(DPV)在0.6 V 內掃描。

1.3 試驗方法

1.3.1 AgCu/His-GQD/G 的制備

氧化石墨烯通過Hummers法獲得[13]。His-GQD根據(jù)文獻[14]報道方法制備。0.5 g氧化石墨烯分散在150 mL 水中以形成均勻的分散液。接著,緩慢加入14 g·L－1His-GQD 溶液50 mL,用1 mol·L－1NaOH 溶液調節(jié)至pH 7.0后,緩慢加入4 mL 的0.1 mol·L－1Ag NO3溶液和3 mL 的0.1 mol·L－1Cu(NO3)2溶液的混合液,形成復合物,以轉速6 000 r·min－1離心,并用水洗滌數(shù)次。收集的固體置于50 ℃真空干燥箱中干燥,最后于400 ℃熱還原2 h,得到AgCu/His-GQD/G。

1.3.2 適配體傳感器的制備

GCE(直徑2.0 mm)用0.05 mm Al2O3拋光處理,接著在水和乙醇中分別超聲5 min,用氮氣吹干備 用。將20 mg AgCu/His-GQD/G 分散于10 mL的1% (質量分數(shù))殼聚糖溶液中,超聲30 min。取5μL溶液滴加到預處理好的GCE表面,室溫下自然干燥后,滴加5μL的8μmol·L－1毒死蜱適配體溶液,于4 ℃放置12 h,接著用PBS(pH 7.4)沖洗電極表面,向電極表面滴加1 mmol·L－1MCH 溶液5μL以封堵非活性位點。將制備好的適配體傳感器置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同法制備克百威和多菌靈適配體傳感器。

1.3.3 毒死蜱、克百威和多菌靈的測定

1)標準品的測定 將5μL毒死蜱標準溶液滴加到適配體傳感器表面,在室溫下溫育40 min,然后使用PBS(pH 7.4)沖洗電極表面,使用DPV 在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)底液中測定。同法測定克百威和多菌靈標準溶液。

2)黃瓜樣品的測定 黃瓜的預處理參照文獻[15]方法,將黃瓜洗干凈,切成小塊,放入榨汁機中榨汁,然后以轉速8 000 r·min－1離心,取上清液按照上述方法測定其中毒死蜱、克百威和多菌靈的含量。

2 結果與討論

2.1 AgCu/His-GQD/G 的制備

AgCu/His-GQD/G 的制備通過3 步完成。首先,將His-GQD 緩慢加至氧化石墨烯溶液中形成復合物,His-GQD 帶有大量的羧基和羥基,可與氧化石墨烯上的含氧基團形成氫鍵。另外,通過His-GQD 上的咪唑環(huán)與氧化石墨烯上的苯環(huán)間的π-π作用,His-GQD 可均勻地固定在氧化石墨烯片上。同時,His-GQD 上大量的親水基團使復合物具有良好的親水性,從而獲得均勻的分散液。接著,將Ag NO3和Cu(NO3)2的混合液緩慢加入上述溶液中,在此過程中,銀離子和銅離子通過與His-GQD上咪唑環(huán)上的氮原子配位,均勻固定在氧化石墨烯片上。并且隨著銀離子和銅離子的不斷加入,銀離子和銅離子能與不同氧化石墨烯片上的咪唑環(huán)配位,導致石墨烯片的聚合,溶液出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,進而形成了三維石墨烯結構。最后,將獲得的復合物在氮氣保護下于400 ℃熱還原。在加熱過程中,氧化石墨烯上的大部分功能基團被分解。同時,復合物上的銀離子和銅離子被還原成銀原子和銅原子,最終形成銀、銅納米粒子,從而獲得AgCu/His-GQD/G。

2.2 AgCu/His-GQD/G 的結構表征

AgCu/His-GQD/G 的結構通過SEM、TEM、XRD 以及拉曼光譜進行表征。圖1(a)為AgCu/His-GQD/G 的SEM 圖,可觀察到AgCu/His-GQD/G 表現(xiàn)出三維結構,且銀、銅納米粒子均勻分散在石墨烯片上。His-GQD 的引入提高了銀、銅納米粒子在石墨烯片上的分散度,使更多的活性位點暴露,提高了復合材料的催化性能。此外,銀、銅納米粒子引入到石墨烯的片層中間,可以有效地阻止石墨烯片的團聚。圖1(b)為AgCu/His-GQD/G 的TEM 圖,可觀察到銀、銅納米粒子均勻分散在石墨烯片上,納米粒子的尺寸為(20±5)nm。圖1(c)為AgCu/His-GQD/G 的XRD 圖,其中26.0°為石墨烯的(002)晶 面,38.4°,44.7°,64.8°,77.7°對應銀 的(111)、(200)、(220)、(311)晶面,43.5°,50.6°,74.1°對應銅的(111)、(200)、(220)晶面。圖1(d)為AgCu/His-GQD/G 的拉曼光譜,1 357 cm－1和1 598 cm－1分別對應的是石墨烯的D 帶和G 帶。

圖1 AgCu/His-GQD/G 的SEM、TEM、XRD和拉曼光譜Fig.1 SEM,TEM,XRD and Raman spectrum of AgCu/His-GQD/G

2.3 適配體傳感器的構建及電化學行為

基于AgCu/His-GQD/G 構建的適配體傳感器用于毒死蜱的測定,其原理如圖2所示。首先,以殼聚糖作為交聯(lián)劑,將AgCu/His-GQD/G 修飾到GCE表面,然后修飾毒死蜱適配體,適配體可以通過氨基與銀、銅作用而固定到電極表面。最后,使用MCH 封堵非活性位點。AgCu/His-GQD/G 具有三維結構,并且因銀、銅納米粒子均勻分布在石墨烯片上而提供了豐富的活性位點,提高了該適配體傳感器的靈敏度?？税偻投嗑`適配體傳感器的構建原理與毒死蜱的相同。

圖2 制備的適配體傳感器用于測定毒死蜱的原理圖Fig.2 Schematic diagram of the prepared aptamer sensor for the determination of chlorpyrifos

適配體傳感器的構建過程通過CV 和EIS進行研 究。CV 和EIS 在含有5 mmol· L－1的[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中進行測定,結果見圖3。

由圖3可知:GCE 顯示出一對氧化還原峰(曲線1);當AgCu/His-GQD/G 修飾到電極表面后,在CV 曲線上的峰電流明顯增加,而在EIS曲線上的電荷轉移電阻Rct減小(曲線2),這是由于AgCu/His-GQD/G 高的電導率加快了[Fe(CN)6]3－/4－氧化還原;當毒死蜱適配體修飾到電極表面,CV 峰電流明顯降低,EIS曲線上的Rct升高(曲線3),這是因為帶有負電荷的適配體阻礙了[Fe(CN)6]3－/4－的氧化還原。MCH 封堵非活性位點后,CV 峰值電流降低并且Rct增加(曲線4)。由此說明適配體傳感器構建成功。

圖3 CV 曲線和EIS曲線Fig.3 CV curves and EIS curves

2.4 電化學響應

將構建的適配體傳感器置于含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中,通 過CV 和DPV 測定1.00 pmol·L－1毒死蜱標準溶液,結果見圖4。

圖4 適配體傳感器與毒死蜱溫育前后的CV 曲線和DPV 曲線Fig.4 CV curves and DPV curves of aptamer sensor and chlorpyrifos before and after incubation

由圖4可知,當毒死蜱接觸到修飾電極表面以后,CV 和DPV 峰電流絕對值都減小,這是由于適配體與毒死蜱結合形成弱導電性復合物,極大阻礙了電解質與電極表面的電子傳遞,導致CV 和DPV的電流都減小。此外,溫育前后毒死蜱在修飾電極上DPV 的信號變化高于CV 的。因此,選擇DPV測定毒死蜱、克百威和多菌靈的含量。

2.5 適配體濃度和溫育時間的優(yōu)化

為了獲得更好的傳感器性能,試驗考察了適配體濃度(2,4,6,7,8,9,10μmol·L－1)和溫育時間(10,20,30,35,40,50,60 min)對適配體傳感器在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中測定0.1 pmol·L－1毒死蜱產生DPV 響應的影響。

結果表明:隨著適配體濃度的增加,適配體傳感器與毒死蜱溫育前后DPV 峰電流的變化(ΔIp)隨之增加;當適配體濃度增加至8μmol·L－1時,ΔIp達到最大值,并保持穩(wěn)定,這是由于隨著適配體濃度增加,更多的毒死蜱與適配體結合形成復合物,弱導電性的復合物導致出現(xiàn)更小的電流、更大的ΔIp;當濃度超過8μmol·L－1時,ΔIp幾乎不變,說明電極表面的適配體的量足以捕捉到所有的毒死蜱。隨著溫育時間的延長,ΔIp隨之增加,這是由于隨著溫育時間的增加,電極表面可以捕捉更多的毒死蜱,更多的適配體-毒死蜱復合物的形成帶來更小的DPV 電流、更大的ΔIp;當溫育時間超過40 min,ΔIp幾乎不變。因此,試驗選擇適配體濃度為8μmol·L－1,溫育時間為40 min。

2.6 選擇性試驗

黃瓜中可能存在其他農藥,如MAL、BOR、DIA、PHO 和CAR 等,試驗考察了上述農藥對使用適配體傳感器測定毒死蜱、克百威、多菌靈的影響。以測定毒死蜱為例,試驗考察了使用構建的適配體傳感器 對0.1 pmol·L－1的MAL、BOR、DIA、PHO、CAR、毒死蜱溶液及上述各物質的混合溶液的DPV 峰電流響應。結果表明:在混合溶液條件下所得的DPV 峰電流與毒死蜱條件下所得的DPV峰電流基本一致;而在MAL、BOR、DIA、PHO、CAR單獨存在條件下所得DPV 峰電流很小。采用相同的方法考察了適配體傳感器對多菌靈和克百威測定的選擇性,得到相同的結果。表明所構建的適配體傳感器具有良好的選擇性。

2.7 標準曲線和檢出限

在最佳條件下,試驗考察了構建的適配體傳感器對毒死蜱標準溶液系列在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中的DPV 行為,結果顯示,隨著毒死蜱濃度的增加,峰電流絕對值隨之減小,且在1.00×10－2～1.00×103pmol·L－1內毒死蜱濃度的負對數(shù)與對應的DPV 峰電流呈線性關系,線性回歸方程和相關系數(shù)見表1。同樣的方法用于測定克百威和多菌靈,其線性參數(shù)見表1。

按照3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),結果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.8 重復性和穩(wěn)定性試驗

試驗分別構建5個適配體傳感器對相同濃度的毒死蜱、多菌靈、克百威的DPV響應進行測定,考察了適配體傳感器的重復性。結果表明,毒死蜱、多菌靈、克百威的DPV 響應測定值的相對標準偏差(RSD)分別為1.5%,2.1%,1.7%,說明構建的適配體傳感器具有良好的重復性。

同樣,對適配體傳感器的穩(wěn)定性進行了考察。將AgCu/His-GQD/G 修飾到電極上,然后修飾毒死蜱適配體,對0.10 pmol·L－1毒死蜱溶液進行DPV 測定,重復測定8 次,其測定結果的RSD 為1.2%。使用同樣方法構建傳感器用于測定10 pmol·L－1多菌靈溶液和10 pmol·L－1克百威溶液,RSD 分別為0.090%和1.1%。此外,將構建的適配體傳感器置于4 ℃冰箱中放置15 d,其峰電流能夠保持起始值的98.7%,98.3%,98.6%,說明構建的適配體傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 樣品分析及回收試驗

按照試驗方法測定兩個黃瓜樣品中毒死蜱、克百威和多菌靈的含量,并進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的RSD,結果見表2。

表2 樣品分析及回收試驗結果(n＝5)Tab.2 Analytical results of the samples and results of test for recovery(n＝5)

由表2可知:黃瓜樣品中僅檢出多菌靈,檢出量分別為1.21,1.25 pmol·L－1;毒死蜱、克百威和多菌靈的回收率為99.3%～100%,說明方法具有較高的準確度。

2.10 方法對比

將本方法與已報道的不同修飾電極構建的傳感器用于測定毒死蜱、克百威和多菌靈的方法進行對比,結果見表3。

表3 方法對比結果Tab.3 Comparison results of different methods

由表3可知,本方法表現(xiàn)出更高的靈敏度。本工作制備了AgCu/His-GQD/G,使用His-GQD實現(xiàn)銀、銅納米粒子在石墨烯片上的固定和分散。該雜化物提供了三維結構,并且銀、銅納米粒子在石墨烯片上均勻分散?；谠撾s化物構建適配體傳感器用于毒死蜱、克百威和多菌靈的測定,表現(xiàn)出高的靈敏度和選擇性。