李章達(dá)

（余姚市大隱鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 余姚 315423）

目前，草莓種質(zhì)資源的選育與遺傳研究，已經(jīng)由原有的形態(tài)多樣性領(lǐng)域，向基因組DNA多樣性領(lǐng)域的方向發(fā)展。而在草莓遺傳育種、遺傳性狀改良的選育培養(yǎng)過程中，涉及到草莓組織培養(yǎng)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、基因工程技術(shù)等。文章主要探討草莓遺傳育種的莖尖、葉片組織培養(yǎng)技術(shù)，以及用于遺傳信息分析的AFLP、RFLP、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)，重點(diǎn)圍繞AFLP的遺傳分子標(biāo)記技術(shù)，建立AFLP銀染的草莓基因組檢測(cè)體系，確定適宜于草莓基因組DNA提取的AFLP分析方法（改良CTAB法），并對(duì)多個(gè)草莓供試樣品的基因組進(jìn)行不同供試類群的品種親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析。

1 草莓遺傳育種中使用的主要生物技術(shù)

1.1 草莓莖尖、葉片、孢子的培養(yǎng)技術(shù)

草莓莖尖、葉片、小孢子等組織器官的培養(yǎng)技術(shù)，在草莓基因組育苗中已得到越來越廣泛的應(yīng)用，如草莓組莖尖、葉片培苗繁殖所產(chǎn)生的匍匐莖苗數(shù)量，要明顯多于普通培苗的莖子苗數(shù)量，且在草莓產(chǎn)量、結(jié)果長勢(shì)方面也更優(yōu)[1]。其中草莓莖尖、葉片、小孢子育苗的培養(yǎng)方法，是將草莓莖尖、葉片等組織器官誘導(dǎo)離體，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液濃度配比、激素刺激條件下，誘導(dǎo)草莓組織的再生植株生長、產(chǎn)生穩(wěn)定性狀的變異植株。而在草莓小孢子組織的遺傳育種培養(yǎng)過程中，可通過游離小孢子離體培養(yǎng)的方式，使用單倍體誘導(dǎo)草莓的倍性育種，設(shè)置適當(dāng)培養(yǎng)液濃度配比、激素刺激的條件，使小孢子發(fā)育成為胚狀體，為草莓原生質(zhì)體培養(yǎng)、分離、遺傳轉(zhuǎn)化提供支持，得到屬間體細(xì)胞融合的新植株。

1.2 基于分子雜交的分子標(biāo)記技術(shù)

分子雜交的遺傳標(biāo)記方法是以RFLP遺傳研究為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。在RFLP標(biāo)記的基礎(chǔ)上，設(shè)置PCR引物組合、限制性內(nèi)切酶，將RFLP轉(zhuǎn)換為成本更低、易于操作的PCRRFLP（即CAPS）標(biāo)記。然后利用分子雜交的PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行草莓供試樣品材料的分類，以及單倍體向多倍體轉(zhuǎn)化形成、親本雜交后的子代親緣關(guān)系的分析，以此完成草莓分子圖譜構(gòu)建、分子遺傳育種的工作。

1.3 基于PCR-AFLP的分子標(biāo)記技術(shù)

當(dāng)前以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，主要包括PCRRAPD、PCR-SSR、PCR-SCAR等的標(biāo)記技術(shù)，也屬于DNA分子標(biāo)記的技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于草莓基因定位、基因克隆、遺傳育種的工作。文章主要選取基于PCR-AFLP的分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)草莓組培苗基因組DNA，對(duì)甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性做出標(biāo)記（MSAP），分析草莓基因組培苗的DNA甲基化變異情況、DNA甲基化程度，以及探討不同類群基因組的DNA序列差異、遺傳穩(wěn)定性，構(gòu)建起一套完整的草莓基因組連鎖圖譜，對(duì)草莓遺傳育種的基因組圖譜建立、抗病性研究等提供支持。

2 草莓遺傳育種AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的執(zhí)行流程

草莓染色體上DNA相對(duì)位置排列的遺傳圖譜，主要根據(jù)草莓作圖群體的生理、生化及形態(tài)特性，使用AFLP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)多個(gè)DNA基因組作出SCAR標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記與特異標(biāo)記，建立二倍體、四倍體及八倍體草莓的遺傳圖譜基因序列[2]。在此基礎(chǔ)上，通過雙假測(cè)交理論支持，分析單劑量限制性片段標(biāo)記、限制性片段長度的多態(tài)性（RFLP），用于判斷染色體DNA的分裂行為。

PCR-AFLP分子標(biāo)記育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)的流程，見圖1。在草莓基因組DNA限制性片段上，通過使用MseI、EcoRI堿基切點(diǎn)酶酶切總DNA，以及對(duì)基因組模板DNA加熱至95℃以上，來放大擴(kuò)增特定的DNA片段，形成具有不同分子量大小的DNA隨機(jī)限制性片段。

圖1 PCR-AFLP分子標(biāo)記育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)的流程Fig.1 The process of PCR-AFLP molecular marker breeding technology

采用特定的雙鏈DNA接頭（adapter），與已完成酶切的DNA限制性片段連接，連接DNA片段的兩端，作為擴(kuò)增反應(yīng)模板。采用含有選擇性堿基的PCR引物，對(duì)特定的雙鏈接頭模板DNA進(jìn)行稀釋擴(kuò)增，其中只有DNA限制性位點(diǎn)核苷酸片段，與引物選擇性堿基的類別、數(shù)量相匹配的才能被擴(kuò)增。在預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)后，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋并作為選擇性擴(kuò)增材料，可提供大量的模板DNA，以及對(duì)模板DNA起到選擇性純化作用。

經(jīng)PCR引物末端、雙鏈DNA接頭序列的識(shí)別，使用放射性同位素對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記，將提取的草莓基因組DNA限制性片段在95℃下變性，對(duì)熱變性后DNA序列作驟然冷卻的淬火處理，延伸循環(huán)性周期而完成擴(kuò)增。利用4%～6%聚丙烯酰胺凝膠的分子篩作用，進(jìn)行基因組DNA特異限制性片段的電泳分離，根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無，檢測(cè)草莓基因組DNA擴(kuò)增片段長度的多態(tài)性。

3 草莓遺傳育種AFLP試驗(yàn)的關(guān)鍵影響因素

3.1 限制性核酸內(nèi)切酶選擇的影響

AFLP分子標(biāo)記的草莓遺傳育種試驗(yàn)，通常會(huì)用到Eco-RI、MseI、MspI、TaqI、HpaIT等的內(nèi)切酶，由于草莓基因組DNA的A、T、G堿基豐度高，因而需使用MseI的多切點(diǎn)酶、EcoRI的少切點(diǎn)酶，進(jìn)行基因組DNA片段的雙酶切[3]。其中MseI限制性核苷酸內(nèi)切酶，可保證基因組DNA酶切片段的分布均勻性，而使用EcoRI內(nèi)切酶的雙酶切，可確保DNA的酶切完全，以及酶切后多個(gè)DNA擴(kuò)增片段多態(tài)的真實(shí)性。

3.2 接頭與引物設(shè)計(jì)的影響

DNA接頭是人工合成的核苷酸雙鏈結(jié)構(gòu)，在基因組DNA進(jìn)行雙酶切過程中，應(yīng)先對(duì)內(nèi)切酶作加熱的變性滅活處理，最后將接頭兩端與限制性核苷酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列連接。這一DNA接頭與酶切片段的連接中，需遵循PCR引物設(shè)置的隨機(jī)原則，從G端開始確定引物選擇性堿基的類別和數(shù)目，堿基數(shù)目在3個(gè)以內(nèi)，引物與模板DNA片段搭配的頻率，隨著選擇堿基數(shù)目的增加而增加。但與此同時(shí)，DNA限制性片段的擴(kuò)增錯(cuò)配頻率上升、擴(kuò)增特異性下降，因而要合理地控制堿基數(shù)目和試驗(yàn)條件。

4 基于PCR-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的草莓遺傳育種試驗(yàn)

4.1 供試材料

文章選取的草莓遺傳育種試驗(yàn)材料，為國家草莓資源圃引進(jìn)的15個(gè)草莓品種，種植于余姚市科學(xué)研究所的試驗(yàn)基地之中，具體數(shù)據(jù)見表1。在供試草莓品種取樣前，應(yīng)提前2 d作草莓材料的遮光栽培，之后選取每個(gè)品種的草莓嫩葉5片左右，做好草莓嫩葉品種標(biāo)記，雙蒸水沖洗一遍、晾干，并放置于-20℃冰盒內(nèi)備用[4]。

表1 草莓遺傳育種的試驗(yàn)材料Tab.1 The experimental materials of strawberry genetic breeding

4.2 主要試驗(yàn)儀器

文章使用的試驗(yàn)儀器有GDS8000凝膠成像系統(tǒng)、GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)、DYY-10型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31D型瓊脂糖水平電泳槽、PCR擴(kuò)增儀、TU-1810型紫外分光光度計(jì)、紫外透射儀、恒溫水浴鍋和微量移液器。

4.3 草莓基因組DNA的提取

利用AFLP分析方法（改良CTAB法），對(duì)草莓葉片基因組DNA進(jìn)行提取。首先配置基本的CTAB分子標(biāo)記提取液，包括20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris-HCl、1.4 mol/L NaCl，在使用前加入10 mmol/L Na2S2O5、2%β-巰基乙醇、1%PVP-40和1%維生素C，用重蒸餾水將溶液pH值調(diào)節(jié)至8.0。具體的草莓基因組DNA提取步驟如下[5]。

（1）取1 g左右的草莓幼嫩葉片，加入液氮研碎成細(xì)粉末，將粉末放置到10 mL離心管中。在離心管中加入預(yù)熱至65℃的CTAB溶液4 mL，混勻后65℃水浴30 min，混勻顛倒3次左右。

（2）將離心管取出后常溫冷卻，加入相同體積的氯仿、異戊醇混合液（V/V=24∶1），混勻后在16℃室溫12 000 r/min離心12 min，取上清液放置到另一離心管中。

（3）在上清液離心管中，加入與上清液2/3體積相同的冰異丙醇，輕輕顛倒混勻，在4℃溫度下12 000 r/min離心8 min，見到絲狀或絮狀沉淀，即為基因組DNA粗提取物。之后用70%乙醇洗滌、沉淀2次，風(fēng)干后加入TE（1 mM EDTA、10 mM Tris（pH值為8.0）），直至DNA提取物完全溶解。

（4）向DNA溶解液中加入10 mg/mLRNase液6 μL，混勻后37℃水浴30 min。之后加入相同體積的氯仿、異戊醇混合液（V/V=1∶1），充分混勻后4℃溫度下12 000 r/min離心8 min，抽提1～2次。

（5）取上清液放置到另一離心管中，繼續(xù)加入相同體積的氯仿、異戊醇混合液（V/V=24∶1），充分混勻后4℃溫度下12 000 r/min離心8 min；取出上清液后加入70%乙醇混勻，可看見成團(tuán)的純化DNA出現(xiàn)，挑出提取的純化DNA繼續(xù)用70%乙醇洗滌3次。

（6）風(fēng)干DNA提取物后，加入50 μL的TE緩沖液溶解，在-20℃冰盒內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

4.4 基因組模板DNA濃度、純度檢測(cè)

常見的基因組模板DNA濃度、純度檢測(cè)方法分為2種：紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法。紫外分光光度法：取3 μL的草莓DNA提取液稀釋100倍至300μL，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm、260 nm波長處的吸光值，見式（1）～（2）：

瓊脂糖凝膠電泳法：取2 μL的草莓DNA提取液，加入溴酚蘭溶液混勻后，在80V電壓、1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。之后使用EB染色，用GDS8000凝膠成像系統(tǒng)拍照，得出DNA是否降解、RNA雜質(zhì)是否去除的結(jié)果。

4.5 草莓AFLP擴(kuò)增反應(yīng)的銀染體系

在PCR-AFLP分子標(biāo)記的適宜范圍內(nèi)，初步確定AFLP擴(kuò)增反應(yīng)體系的各組份含量，具體如下：30 mg模板DNA、0.15 μL EcoRI、0.3 μL MseI、2 μL 10×Buffer、0.5 μmol/L引物、10 mM ATP。PCR-AFLP擴(kuò)增反應(yīng)的執(zhí)行程序?yàn)椋?4℃下預(yù)變性5 min，95℃下熱變性40 s。DNA提取物熱變性后，在引物退火溫度下作驟然冷卻的淬火處理（退火60 s），在72℃下延伸循環(huán)性周期35次而完成擴(kuò)增，溫度降至4℃時(shí)停止。

5 基于PCR-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的草莓遺傳育種結(jié)果分析

5.1 草莓AFLP擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)以上的草莓PCR-AFLP擴(kuò)增反應(yīng)程序，對(duì)草莓基因組DNA提取物作正交電泳試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。根據(jù)圖2的正交試驗(yàn)擴(kuò)增電泳圖可以得出，基于PCR-AFLP分子標(biāo)記的正交試驗(yàn)，可以擴(kuò)增出草莓基因組DNA較清晰的條帶。其中第6組相比于其他組的擴(kuò)增處理效果，有著更加清晰、完整的擴(kuò)增譜帶[6]。

圖2 草莓PCR-AFLP擴(kuò)增反應(yīng)的電泳試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The electrophoresis test results of strawberry PCR-AFLP amplification reaction

5.2 草莓供試品種的遺傳育種多樣性分析

本試驗(yàn)共篩選出具有豐富多態(tài)性的引物共4條，每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶4～10條，一共產(chǎn)生38條譜帶。其中多態(tài)性譜帶32條，多態(tài)性比率占比為78.75%，具體的引物編號(hào)、總譜帶數(shù)、共同譜帶數(shù)、多態(tài)性譜帶數(shù)數(shù)據(jù)見表2。

表2 草莓基因組DNA引物擴(kuò)增的譜帶數(shù)據(jù)Tab.2 The band data of strawberry genomic DNA primer amplification

根據(jù)表2的草莓基因組DNA引物，以及圖3的電泳譜帶擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建聚類樹狀圖（見圖4），得出15份草莓供試材料的遺傳相似系數(shù)為0.71～0.99，其中法蘭地、甜查理之間遺傳相似系數(shù)最高為0.99，其他同一國家草莓供試品種的遺傳相似系數(shù)也在0.95以上，不同國家草莓供試品種的遺傳相似系數(shù)，則低至0.71～0.80。因而，從分子水平驗(yàn)證親本雜交后的子代親緣關(guān)系，可選擇法蘭地、甜查理的供試品種雜交，得到質(zhì)量更加優(yōu)良、產(chǎn)量高的草莓基因組DNA。

圖3 草莓基因組DNA引物的電泳譜帶擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The electrophoresis band amplification results of strawberry genomic DNA Primers

圖4 草莓遺傳育種的品種聚類樹狀圖Fig.4 The variety clustering tree of strawberry genetic breeding

6 結(jié)語

草莓在不同地區(qū)有著多樣化的品種分布，如何通過生物遺傳育種技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)某一類草莓品種作組織培養(yǎng)、分子標(biāo)記，成為優(yōu)質(zhì)大粒草莓品種篩選及栽培關(guān)注的重要方向。文章所研究的草莓供試品種的遺傳育種多樣性分析結(jié)果得出：AFLP分子標(biāo)記技術(shù)（改良CTAB法）在草莓遺傳育種中的應(yīng)用，可解決供試樣品基因組DNA提取不完全問題，且通過篩選多種引物組合、類群聚類分析，得出較為客觀準(zhǔn)確的草莓供試樣品的類群相似度及各系間的親緣關(guān)系結(jié)果。