錢美芳，張艷，尤倩，趙薇

支氣管哮喘是世界范圍內最常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率每年增加，已成為全球公共衛(wèi)生問題，嚴重影響病人生命健康和生活質量［1］。支氣管哮喘的發(fā)病機制非常復雜，目前研究認為其發(fā)病機制有氣道高反應性、免疫變態(tài)反應、氣道炎癥等［2-3］。研究表明，CD4+T淋巴細胞作為關鍵的淋巴細胞，參與哮喘的免疫過程，其分化的T輔助細胞失衡已被認為是哮喘發(fā)病的經典免疫理論，但其無法完全解釋哮喘發(fā)病機制［4］。程序性死亡因子-1（programmed death factor-1，PD-1）及 其 配 體（programmed death ligand-1，PD-L1）是近年來發(fā)現(xiàn)的負性協(xié)同刺激分子，是多種免疫反應的關鍵調節(jié)因子，在自身免疫和自身耐受以及癌癥免疫學中發(fā)揮關鍵作用，PD-1/PD-L1通路已成為免疫治療的新靶點［5］。目前PD-1/PD-L1表達與急性支氣管哮喘發(fā)病及病情嚴重程度的關系尚不十分明確，本研究通過檢測急性支氣管哮喘病人外周血CD4+T淋巴細胞中PD-1（CD4+PD-1）、CD8+T淋 巴 細 胞 中PD-1（CD8+PD-1）、CD19+B淋巴細胞中PD-L1（CD19+PD-L1）的表達，分析其與疾病嚴重程度的關系，并探討其在支氣管哮喘發(fā)生及發(fā)展中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究采用前瞻性研究的方法，選擇2017年2月至2019年3月無錫市第五人民醫(yī)院收治的101例急性支氣管哮喘病人作為病例組研究對象，其中男58例，女43例，年齡范圍21～48歲，年齡（34.56±10.29）歲。納入標準：（1）符合《支氣管哮喘防治指南（2016）版》中哮喘診斷標準，表現(xiàn)為喘息、氣急等癥狀突發(fā)或加重，呼氣流量降低等急性發(fā)作特征［6］；（2）自愿加入研究，能配合研究。排除標準：（1）慢性持續(xù)性哮喘者；（2）慢性阻塞性肺疾病、變態(tài)反應性肺浸潤及氣管、主支氣管肺癌者；（3）左心衰竭等其他原因引起的喘息樣呼吸困難者；（4）合并類風濕性關節(jié)炎、慢性肝病、皮膚病等其他免疫性疾病者；（5）近期內接受過免疫治療者；（6）臨床病理資料缺失者。另選擇同時期體檢健康且無個人或家族過敏史或哮喘史的40例為對照組，男23例，女17例，年齡范圍25～55歲，年齡（38.11±12.54）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具有可比性。本研究獲無錫市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準（批號為無錫五院論文倫字第2020-017-1），病人及其近親屬知曉研究方案并簽署知情同意書。

1.2 分組根據(jù)哮喘急性發(fā)作期病情嚴重程度［6］，其中輕中度46例（輕中度組），重度34例（重度組），危重21例（危重組）。輕中度組男26例、女20例，年齡范圍21～47歲、年齡（33.90±10.02）歲；重度組男19例、女15例，年齡范圍21～48歲、年齡（34.71±10.38）歲；危重組男13例、女8例，年齡范圍22～48歲、年齡（35.14±10.55）歲。三組性別、年齡相比差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具有可比性。

1.3 研究方法①采集急性支氣管哮喘病人入院時及對照組健康體檢時肘靜脈血5 mL，取3 mL加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用于檢測外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表達水平；另2 mL室溫靜置30 min，1 600 r/min離心5 min，提取上清，用于檢測白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）水平。②取50 μL血液分裝至新的無菌試管，分別加入CD4-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD8-FITC，CD19-FITC、PD-1抗體、PD-L1抗體，避光震蕩混勻30 min，按1∶5比例向各試管中加入溶血劑，40～50℃恒溫下震蕩至溶液透明亮（紅細胞溶解），1 600 r/min離心5 min，棄上清，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2次，避光下加入含1%多聚甲醛的PBS溶液固定，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）檢測外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表達水平，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)，并計算PD-1/PD-L1值。實驗用抗體購于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。③采用瑞士艾科EcoMedics化學發(fā)光分析儀（瑞士ECO公司）檢測受試者呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO）水平。④采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測外周血IL-4、IL-17水平，人IL-4 ELISA、人IL-17 ELISA檢測試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司，實驗方法嚴格參照試劑說明書進行。

1.4 觀察指標①比較對照組和病例組外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表 達 水 平 及PD-1/PD-L1值。②比較對照組和病例組FeNO及外周血IL-4、IL-17水平。③比較病例組病人不同病情嚴重程度外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PDL1表達水平及PD-1/PD-L1值。④比較病例組病人外周血PD-1/PD-L1表達水平與FeNO、IL-4、IL-17水平的關系。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，多組有統(tǒng)計學差異時以LSD-t檢驗進行兩兩比較|；采用Pearson相關系數(shù)分析外周血PD-1/PD-L1表達水平與FeNO、IL-4、IL-17水平的相關性。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血中PD-1/PD-L1表達水平病例組外周血CD4+PD-1表達水平高于對照組（P＜0.05）；兩組外周血CD8+PD-1表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；病例組外周血CD19+PD-L1表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；病例組外周血PD-1/PD-L1比值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 體檢健康者40例與急性支氣管哮喘101例外周血中PD-1/PD-L1表達水平比較/

表1 體檢健康者40例與急性支氣管哮喘101例外周血中PD-1/PD-L1表達水平比較/

注：PD-1為程序性死亡因子-1，PD-L1為程序性死亡因子-1配體，CD4+PD-1為CD4+T淋巴細胞中PD-1，CD8+PD-1為CD8+T淋巴細胞中PD-1，CD19+PD-L1為CD19+B淋巴細胞中PD-L1。

組別對照組病例組t值P值例數(shù) 4 0 101 CD4+PD-1 5.43±1.52 17.98±4.16 18.56＜0.001 CD8+PD-1 3.06±0.98 3.75±1.12 0.45 0.657 CD19+PD-L1 1.08±0.27 3.13±0.75 16.83＜0.001 PD-1/PD-L1（CD4+PD-1/CD19+PD-L1）5.03±1.11 5.75±1.62 2.58 0.011

2.2 兩組FeNO及外周血IL-4、IL-17水平病例組FeNO水平高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；病例組外周血IL-4水平低于對照組，IL-17水平高于對照組，兩組比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 體檢健康者40例與急性支氣管哮喘101例FeNO及外周血IL-4、IL-17水平比較/

表2 體檢健康者40例與急性支氣管哮喘101例FeNO及外周血IL-4、IL-17水平比較/

注：FeNO為呼出氣一氧化氮，IL-4為白細胞介素4，IL-17為白細胞介素17。

組別對照組病例組t值P值例數(shù)40 101 FeNO/（μg/L）16.38±4.12 29.74±6.08 12.77＜0.001 IL-4/（ng/L）12.86±3.65 9.14±2.47 6.99＜0.001 IL-17/（ng/L）24.73±5.21 38.66±8.27 9.89＜0.001

2.3 病例組不同嚴重程度外周血PD-1/PD-L1表達水平危重組外周血CD4+PD-1表達水平均高于重度組和輕中度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；重度組外周血CD4+PD-1表達水平高于輕中度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；三組外周血CD8+PD-1表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；危重組外周血CD19+PD-L1表達水平高于重度組和輕中度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度組外周血CD19+PD-L1表達水平高于輕中度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；危重組和重度組PD-1/PD-L1比值高于輕中度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），危重組和重度組間PD-1/PD-L1比值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同嚴重程度急性支氣管哮喘101例外周血PD-1/PD-L1表達水平/

表3 不同嚴重程度急性支氣管哮喘101例外周血PD-1/PD-L1表達水平/

注：PD-1為程序性死亡因子-1，PD-L1為程序性死亡因子-1配體，CD4+PD-1為CD4+T淋巴細胞中PD-1，CD8+PD-1為CD8+T淋巴細胞中PD-1，CD19+PD-L1為CD19+B淋巴細胞中PD-L1。①與輕中度組比較，P＜0.05。②與重度組比較，P＜0.05。

組別輕中度組重度組危重組F值P值例數(shù) 4 6 34 21 CD4+PD-1 16.54±3.11 18.17±3.84①20.83±4.02①②10.52＜0.001 CD8+PD-1 3.63±0.87 3.81±0.95 3.92±1.06 0.79 0.457 CD19+PD-L1 2.93±0.46 3.12±0.32①3.58±0.57①②15.40＜0.001 PD-1/PD-L1（CD4+PD-1/CD19+PD-L1）5.64±0.24 5.82±0.31①5.81±0.22①5.67 0.005

2.4 病例組外周血PD-1/PD-L1表達水平與Fe-NO、IL-4、IL-17水平的關系病例組外周血CD4+PD-1表達水平與FeNO呈正相關關系（r=0.61，P＜0.001），與IL-4呈負相關關系（r=-0.43，P=0.024），與IL-17呈 正 相 關 關 系（r=0.51，P=0.019）；外 周 血CD19+PD-L1表達水平與FeNO呈正相關關系（r=0.55，P=0.015），與IL-4呈負相關關系（r=-0.38，P=0.037），與IL-17呈正相關關系（r=0.50，P=0.021）。見圖1。

圖1 病例組外周血PD-1/PD-L1表達水平與呼出氣一氧化氮（FeNO）、白細胞介素（IL）-4、IL-17水平的相關性

3 討論

PD-1及其配體PD-L1屬于CD28/B7蛋白家族成員，參與T淋巴細胞共刺激信號傳遞，并作為調節(jié)T細胞免疫應答和T細胞介導外周免疫耐受的關鍵因素［7］。已有研究表明，PD-1/PD-L1信號通路與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝炎、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病密切相關［8-10］。因此，PD-1/PD-L1信號通路已成為研究自身免疫性疾病發(fā)病機制及靶向治療的新途徑。本研究結果，與健康者相比，急性支氣管哮喘病人外周血CD4+PD-1表達水平升高，CD19+PD-L1表達水平升高，且PD-1/PD-L1比值高于健康者。觀察PD-1/PD-L1在不同病情嚴重程度病人中的表達發(fā)現(xiàn)，隨病情嚴重程度增加，外周血PD-1/PD-L1呈升高趨勢。說明外周血PD-1/PD-L1表達與急性支氣管哮喘病人病情嚴重程度有關，病情越嚴重，外周血PD-1/PD-L1表達可能越高。與PD-1/PD-L1介導抑制T細胞活化增殖，誘導保護性免疫等負性免疫調節(jié)作用理論相反［11］，支氣管哮喘病人外周PD-1/PD-L1表達升高似乎并未控制病情發(fā)展。PD-1/PD-L1在支氣管哮喘中的作用可能存在多樣性。

輔助性T細胞2（helper T cell 2，Th2）/輔助性T細胞（helper T cell 17，Th17）間的平衡是哮喘發(fā)病重要免疫機制，Mcalees等［12］以過敏性哮喘小鼠模型為對象，PD-1/PD-L1對不同CD4+T細胞亞群具有不同影響，阻斷PD-1/PD-L1可通過促進Th17細胞型免疫應答而增強氣道高反應性，證實PD-1/PDL軸通過抑制Th17細胞活性而控制哮喘嚴重程度，提示嚴重過敏性哮喘可能與PD-1/PD-L1調節(jié)軸缺失有關。此外，Th17和調節(jié)性T細胞（Regulatory cells，Treg）間的平衡是哮喘發(fā)病機制的新模式，Xi等［13］研究表明，哮喘病人Treg細胞中PD-1表達明顯高于Th17細胞中PD-1表達，而PD-L1表達明顯低于Th17細胞中PD-L1表達，體外給予抗PD-1可降低哮喘病兒CD4+T細胞中Th17細胞，而增加Treg細胞百分比，提示抗PD-1治療對哮喘模型具有保護作用。說明PD-1/PD-L1在不同T淋巴細胞具有不同調節(jié)作用。本研究相關性分析顯示，急性支氣管哮喘病人外周血PD-1/PD-L1表達與FeNO、IL-17呈正相關關系，與IL-4呈負相關關系。FeNO作為評估氣道炎癥和哮喘控制水平的指標，反映病人氣道炎癥水平和哮喘嚴重程度［14］。IL-4是由Th2分泌的免疫因子，對T細胞、B細胞、巨噬細胞等都有免疫調節(jié)作用，而IL-17由Th17分泌為促炎因子，反映機體炎癥水平［15-16］。說明急性支氣管哮喘病人外周血PD-1/PD-L1表達與氣道炎癥和病情嚴重程度有關，推測PD-1/PD-L1過高表達可能通過擾亂Th2/Th17、Th17/Treg細胞之間的平衡介導免疫反應，與張宏宇等［17］在自身免疫性肝炎中的研究結果相似。

目前尚無完全治愈支氣管哮喘的藥物，特異性免疫治療是世界衛(wèi)生組織推薦的唯一針對支氣管哮喘病因的治療方法［18］。臨床研究表明，特異性免疫治療能夠有效改善病人臨床癥狀、減少藥物使用量及改善敏感狀態(tài)［19］。因此，發(fā)現(xiàn)哮喘病人T淋巴細胞亞群失衡的調控機制，有助于靶向治療提高臨床療效。

綜上所述，急性支氣管哮喘病人外周血T淋巴細胞中PD-1/PD-L1異常表達，可能通過擾亂Th2、Th17、Treg等細胞平衡，調節(jié)病人免疫狀態(tài)，與病人病情嚴重程度密切相關。但由于PD-1/PD-L1表達的廣泛性及其在免疫反應調節(jié)中的復雜性，其對急性支氣管哮喘嚴重程度的預測價值及臨床治療價值仍需進一步深入探究。