王冰，曹春琪，馮亞楠，李冬梅，劉永利

血塞通注射液是由三七總皂苷配制成的中藥注射劑，用于中風偏癱、瘀血阻絡證［1］。血塞通注射液有機成分的研究較為成熟［2-5］，其無機元素的研究則鮮有報道。有研究表明，無機元素與藥效活性成分存在一定的相互作用［9］，研究血塞通注射液中無機元素，明確無機元素的種類及含量，有利于更全面地掌握藥效成分及藥理作用，進一步保障注射液的質(zhì)量穩(wěn)定性及安全性。

本研究于2018年2月至2022年6月采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）法測定鈉（Na）、鉻（Cr）等40種元素含量，分析血塞通注射液中無機元素的分布特征。以期為注射液的安全性評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（PerkinElmer NexlON 2000），微波消解儀（CEM 6 CLASSIC），電熱板（上海博通BHW-09C）。

色譜級硝酸（fisher scientific公司），去離子水；Sc單元素標準溶液購自壇墨質(zhì)檢科技有限公司；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn多元素標準溶液購自鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司，其他購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。6批次血塞通注射液均購自河北省石家莊市零售藥店，來自兩家生產(chǎn)企業(yè)，編號分別為Z01、Z02、Z03、B01、B02、B03。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)譜條件 射頻功率：1 600 W，輔助氣/氬氣流量1.2 L/min，霧化氣（氬氣）流量0.98 L/min，蠕動泵35 r/min。碰撞模式為kenetic energy discrimination（KED），氦氣體積流量：4.0 mL/min，采樣3次。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 內(nèi)標溶液的制備 精密量取Sc、Rh、Re單元素標準溶液適量，用水稀釋制成每1 mL各含50 ng的混合溶液；精密量取Sc、Y、Tb單元素標準溶液適量，用水稀釋制成每1 mL各含50 ng的混合溶液。

1.2.2.2 標準品儲備溶液的制備 分別精密量取相應的標準溶液，用2%硝酸溶液稀釋，制成含Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Ba素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標準儲備溶液1；含Hg元素質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL標準儲備溶液2；其他元素質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標準儲備溶液3。

1.2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別精密量取相應的標準儲備溶液，用2%硝酸溶液稀釋，制成含Li、Be、B、Ti、V、Cr、Co、Ni、Ga、Ge、As、Sr、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Sn、Sb、Te、Hf、W、Re、Ir、Pt、Au、Tl、Pb、Bi元素質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、50 μg/L，含Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Ba素質(zhì)量濃度分別為10、50、100、200、500 μg/L，含Hg元素質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5 μg/L系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

1.2.2.4 供試品溶液的制備 精密量取供試品2 mL，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5 mL，按微波消解程序（10 min升溫至120℃，保持2 min，5 min升溫至150℃保持5 min，5 min升溫至190℃保持45 min）進行消解，消解結(jié)束后，冷卻至60℃以下，取出消解罐，置于105℃電熱板上加熱趕酸至1 mL左右，消解罐放冷后，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，合并洗滌液于量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

同法制備試劑空白溶液。

1.2.3 測定法 根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小選擇內(nèi)標物，其中7Li、9Be、11B、48Ti、51V、52Cr、59Co、60Ni、23Na、24Mg、27Al、39K、43Ca、55Mn、57Fe、63Cu、66Zn以45Sc作為內(nèi)標；69Ga、74Ge、75As、88Sr、102Ru、103Rh、106Pd、111Cd、115In、118Sn、121Sb、130Te以89Y作為內(nèi) 標；180Hf、184W、187Re、193Ir、195Pt、197AU、205Tl、208Pb、209Bi以159Tb作為內(nèi)標；138Ba以103Rh作為內(nèi)標；202Hg以187Re作為內(nèi)標。對上述溶液進行測定，采用標準曲線法定量計算。

2 結(jié)果

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察 按照“1.2.2.3”項下方法配制混合對照品溶液，按“1.2.1”項下的儀器參數(shù)進行檢測，以標準品濃度為橫坐標、儀器響應值為縱坐標建立線性回歸方程，各元素線性相關系數(shù)均r≥0.99。

2.1.2 檢出限和定量限 重復測定空白溶液10次，各元素信號響應值的3倍標準偏差對應的元素濃度即為檢出限；各元素信號響應值的10倍標準偏差所對應的元素濃度即為定量限，見表1。

表1 血塞通注射液中40種無機元素方法學考察結(jié)果

2.1.3 精密度試驗 取標準曲線第4點混合標準溶液，連續(xù)進樣6次，分別以各元素測量值計算RSD，各元素的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 取樣品6份，按照“1.2.2.4”項下制備方法制得供試品溶液，進樣檢測分析，結(jié)果各元素測量值的RSD均小于6%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 在2 h內(nèi)等時間間隔連續(xù)測定8次，以各元素測量值計算RSD，各元素的RSD均小于5%，表明穩(wěn)定性良好。

2.1.6 回收率試驗 精密量取供試品各2 mL，分別置耐壓耐高溫微波消解罐中，共9份，分為3組，每組3份平行樣，分別精密加入標準儲備溶液1、標準儲備溶液2、標準儲備溶液3各0.25、0.5、1 mL，按“1.2.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，進樣檢測，平均回收率在87.2%～113.8%。

2.2 元素測定結(jié)果按照“2.3”項下測定法測定并計算血塞通注射液中40種無機元素的含量，結(jié)果見表2。

表2 血塞通注射液中40種無機元素的含量/（mg/kg）

2.3 結(jié)果直觀分析由表2可知，兩家企業(yè)共6批樣品的40種有機元素檢測中，24種元素均有不同程度的檢出，含量相對較高的是人體必需元素Na、Mg、K、Ca等。企業(yè)間存在明顯差異的有7個元素，包括Na、Mg、K、Ca、Fe等。參照《中國藥典》2020年版四部，血塞通注射液按每日最大使用量8 mL計算，鉛、鎘、砷、汞、銅應分別不得超過12、3、6、2、150 μg［10］，本結(jié)果中Cu、As均未超過限度。

2.4 特征圖譜分析將測定的40種無機元素按其原子序數(shù)順序作為橫坐標，相對含量作為縱坐標繪制分布曲線（Na、K、Mg、Ca含量的數(shù)量級縮小100倍；B、Mn、Fe、Cu、Sr、Pd、Ba的數(shù)量級縮小10倍）?？芍庇^顯示出不同批次間存在一定的差異，但總體呈現(xiàn)輪廓一致。

2.5 化學計量學分析

2.5.1 相關性分析 使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行Pearson相關性分析，結(jié)果表明40種無機元素中，Cu與Na、K、Mg、Ca、Fe、Sr呈極顯著性正相關，而As與Na、K、Mg呈極顯著性正相關、與Bi呈極顯著性負相關（P＜0.01）。

2.5.2 主成分分析 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析［11］，結(jié)果見表3，采用特性值大于1為提取條件，得到3個主成分，累計方差貢獻率為92.046%，反映3個主成分因子可以作為血塞通注射液無機元素的評價指標。根據(jù)得到的因子載荷矩陣，以絕對值為依據(jù)，3個主成分的構(gòu)成成分圖見圖1。繪制得分圖，見圖2。

表3 主成分特征值及方差貢獻率

6批樣品在空間中可分為兩組，一家企業(yè)的3批樣品相對聚攏，而另一家企業(yè)的3批樣品直接存在一定距離，顯示企業(yè)間存在明顯差異，且同企業(yè)不同批次間無機元素的含量也有一定的差異。

2.6 風險評估按照危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4個步驟對血塞通注射液進行健康風險評價［12-14］。

2.6.1 危害識別、危害特征描述 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）規(guī)定Cu的暫定最大理論日攝入量（PMTDI）為50 μg·kg-1·bw-1［15］；WHO提出As的每日基準劑量下限值（BMDL0.5）為3.0 μg·kg-1·bw-1［16］；美國國家環(huán)保署（USEPA）提出的Cr每日最大理論攝入量TDI為3 μg·kg-1·bw-1作為健康指導值［17］。將各元素健康指導值統(tǒng)一折算為每千克體質(zhì)量每日允許攝入量（ADI），即As、Cu、Cr的ADI值分別為3.0、50和3.0 μg·kg-1·bw-1（bw為體質(zhì)量）。

2.6.2 暴露評估 以重金屬及有害元素殘留值測定值和臨床用量為基礎，進行長期暴露評估［18］。

公式1中：Exp為日暴露量，以每千克體量每日重金屬攝入量表示，單位為μg·kg-1·bw-1；EF為暴露頻率，以90天/年計；ED為暴露年限，以一生使用中藥常規(guī)年限20年計；M為日最大攝入量，說明書中規(guī)定靜脈滴注血塞通注射液為0.4 g；C為樣品中重金屬及有害元素殘留值，以各元素最高殘留量計，單位為mg/kg；AT為平均壽命天數(shù)，以365×70年計；W為人體平均體質(zhì)量，以63 kg計。

根據(jù)公式計算血塞通注射液中As、Cu、Cr的日暴露量（Exp/μg·kg-1·bw-1）分別為0.006、0.13、0.008，遠低于As、Cu、Cr的日允許攝入量（ADI/μg·kg-1·bw-1）0.006、0.13、0.008。顯示正常劑量的血塞通注射液不會對健康人群產(chǎn)生不可接受的健康風險。

2.6.3 風險特征描述 重金屬元素的危害指數(shù)（HI）計算公式：

公 式2中：Exp為日暴露量，單位為 μg·kg-1·bw-1；10為《中國藥典》2020年版“9302中藥有害殘留物限量制定指導原則”規(guī)定的安全因子，表示每日由藥品中攝取的重金屬及有害元素的量不大于日總暴露量（包括食物和飲用水）的10%；HBGV為健康指導值，單位為μg·kg-1·bw-1。

評判標準為：危害指數(shù)HI≤1，中藥中重金屬及有害元素的健康風險較低；HI＞1，風險應予以關注。

計算得到血塞通注射液中As、Cu、Cr的HI分別為0.02、0.03、0.03，表明血塞通注射液中重金屬及有害元素的健康風險較低。

3 討論

無機元素既包括人體必需的微量元素，也包括對人體有害的元素［19-20］。中藥材無機元素的含量與環(huán)境土壤中元素含量、存在形態(tài)、活性及不同品種對元素的吸收、運輸特性均有關［21-22］。此次測定血塞通注射液中40種元素，既有人體必需的Na、Mg、K、Ca等，也有Pb、Cr、As、Hg、Cu等有害元素，可全面評估血塞通注射液無機元素整體狀況。

本研究收集到的為市場流通量大的兩家企業(yè)產(chǎn)品。從構(gòu)建的特征圖譜可以直觀看出，企業(yè)間樣品存在明顯差異，但各元素具有相似的分布形態(tài)，具有整體趨勢一致的特征性，可應用無機元素的特征圖譜對血塞通注射液進行質(zhì)量差異評價。通過化學計量學分析，不同批次間的血塞通注射液中無機元素的含量也有一定的差異，有害元素Cu、As與人體必需元素Na、K、Mg等呈現(xiàn)出極顯著性正相關，表明無機元素之間存在相互作用。不同生產(chǎn)企業(yè)間存在明顯差異，且同企業(yè)不同批次間無機元素的含量也有一定的差異。對血塞通注射液進行健康風險評價，結(jié)果顯示此次測定的血塞通注射液樣品中重金屬及有害元素的健康風險較低，正常使用劑量不會對正常人群產(chǎn)生不可接受的健康風險。

本研究建立血塞通注射液中40種無機元素含量測定方法，為構(gòu)建血塞通注射液整體質(zhì)量安全評價體系擴寬了思路。