范秋雨，武建文，李煥榮

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 102206)

槐花為豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥花蕾及花，又名槐米、洋槐花，植物槐被譽(yù)為“中國(guó)學(xué)者樹”，是中國(guó)衛(wèi)生健康部門首批公布的藥食兩用型花卉植物[1]。中國(guó)是藥用植物槐花的原產(chǎn)地及主要出口國(guó)，槐米資源豐富，既可食用又是一味良藥?；被ㄎ犊啵⒑?，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、清肝瀉火功能，用于便血、痔瘡出血、崩漏、吐血、肝熱目赤、血痢、頭暈等癥[2]。不同炮制方式的槐花具有不同的功效，如槐花炭的涼血作用微弱，止血作用強(qiáng)[3]。

槐花的活性成分有植物甾類、鞣質(zhì)、槲皮素[4]、山奈酚、異黃酮，異鼠李素、染料木素、蘆丁[5]等多種黃酮類化合物?；被ㄓ幸种蒲“寰奂痆6]、抗氧化[7]和抗炎[8]等功能，可增加毛細(xì)血管的穩(wěn)定性，降低毛細(xì)血管的通透性和血管的脆性，減少患者因糖尿病合并高血壓出現(xiàn)的腦出血現(xiàn)象[9]。此外，槐花中的芳香甙能顯著抑制大鼠創(chuàng)傷性腳爪浮腫和阻止肺水腫、結(jié)膜炎的發(fā)生[10]。黃敏[11]研究結(jié)果顯示，復(fù)方槐花口服液除具有鎮(zhèn)痛、止血及抗局部感染的作用之外，還能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓的炎癥腫脹。但槐花的主要作用成分、靶點(diǎn)和抗炎機(jī)制尚未明確。

鑒于此，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，全面、系統(tǒng)地分析藥用槐花的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路及抗炎作用機(jī)制，探究其潛在網(wǎng)絡(luò)化關(guān)聯(lián)，以期為進(jìn)一步闡明槐花抗炎機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 槐花潛在活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP，https:∥tcmsp-e.com/)檢索槐花的全部化合物成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)[12]，以口服生物利用度(oral bio-availability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[13]，篩選槐花有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 靶點(diǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)中下載人類全基因名稱與槐花成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行一一匹配，得到相應(yīng)靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱，將活性成分和靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件，以構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖[14]。

1.3 抗炎靶點(diǎn)篩選及有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards(https:∥www.genecards.org/)、OMIM(https:∥www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索抗炎相關(guān)的靶蛋白。提取槐花成分靶點(diǎn)與抗炎靶點(diǎn)的共有基因作為核心靶點(diǎn)，再將篩選出的活性成分及其作用的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建成分-抗炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作(PPI) 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將篩選出的槐花主要靶點(diǎn)蛋白制表，按指引上傳至STRING平臺(tái)(https:∥string-db.org/)，物種設(shè)定為人，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖[15]。再將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，利用插件“Network Analyse”的功能進(jìn)行分析。度值和介數(shù)是反映一個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的指標(biāo)，選取度值和介數(shù)均高于平均值的靶標(biāo)作為關(guān)鍵靶標(biāo)，分析槐花抗炎靶點(diǎn)之間的相互作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥david.ncifcrf.gov/)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析[16]。

2 結(jié) 果

2.1 槐花潛在活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得槐花的化學(xué)成分27種，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選槐花有效成分，共獲得槲皮素、異鼠李素、山奈酚、β-谷甾醇、N-[6-9-吖啶基氨基己基]苯甲酰胺、槲皮素-3-甲基醚6種活性成分，其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)297個(gè)。具體信息見(jiàn)表1。

表1 槐花活性成分篩選結(jié)果

2.2 槐花活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將TCMSP預(yù)測(cè)得到的297個(gè)靶蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的靶基因，物種設(shè)定為人，得到229個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化基因。將篩選出的6種活性成分及其作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。由圖1可知，其包括163個(gè)節(jié)點(diǎn)(6種活性成分和157種相關(guān)靶點(diǎn))和229條線，MOL000098(槲皮素)節(jié)點(diǎn)的連線最多,說(shuō)明其在與靶點(diǎn)蛋白相互作用中起到關(guān)鍵作用，可能是槐花發(fā)揮藥效的主要成分，其次是異鼠李素、山奈酚等物質(zhì)。

圖1 槐花主要有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 抗炎靶點(diǎn)篩選及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果

從NCBI、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)里以“Anti-inflammatory”為關(guān)鍵詞搜索抗炎基因，共找到10 030個(gè)抗炎基因。將229個(gè)槐花靶基因與10 030個(gè)抗炎相關(guān)基因映射后，得到共同靶基因221個(gè)，即為槐花抗炎作用靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件將6種活性成分及221個(gè)靶基因建立的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得165個(gè)節(jié)點(diǎn)、387條邊(圖2)，充分體現(xiàn)了槐花多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。

圖2 槐花有效成分-抗炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點(diǎn)PPI結(jié)果

由圖3可知，映射得到的221個(gè)靶基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中包含152個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 579條相互作用連線。PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為33.9，平均介數(shù)為0.638。據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，共篩選出34個(gè)度值和介數(shù)均超過(guò)平均值的關(guān)鍵靶蛋白(IL10、NFKBIA、ICAM1、MMP2、BCL2L1、STAT1、VCAM1、IFNG、MAPK14、IL2、SERPINE1、CASP9、IKBKB、GSK3B、CRP、IL1A、MMP3、MPO、MMP1、NOS2、SELE、SPP1、PRKCA、CDKN1A、CXCL10、CCNB1、CD40LG、ESR2、HSPB1、RUNX2、CHUK、RB1、RAF1和IGFBP3)，即這34個(gè)靶點(diǎn)為槐花發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圓圈代表目標(biāo)蛋白質(zhì)，直線代表蛋白質(zhì)之間相互作用；兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用越強(qiáng)，其連線越粗；不同顏色和形狀的線表示不同的相互作用

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

使用DAVID 6.8平臺(tái)對(duì)篩選出的6個(gè)槐花抗炎活性關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析得到GO條目24個(gè)(P<0.01)，其中與生物過(guò)程相關(guān)的條目16個(gè)，即RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、正調(diào)控轉(zhuǎn)錄DNA模板、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；與分子功能相關(guān)的條目6個(gè)，即酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)合等；與細(xì)胞組分相關(guān)的條目2個(gè)，即細(xì)胞外間隙和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(圖4)，KEGG信號(hào)通路21條(P<0.01，表2)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)基因與癌癥、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ感染、甲型流感等信號(hào)通路密切相關(guān)。KEGG信號(hào)通路富集分析表明其他相關(guān)信號(hào)通路為TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路(圖5)。

圖4 槐花活性關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能分類

表2 槐花抗炎活性關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)KEGG信號(hào)通路

續(xù)表

3 討 論

槐花是一種具有涼血止血、清肝瀉火[17]等功效的藥食兩用植物。多數(shù)藥用植物的抗炎作用是對(duì)機(jī)體多環(huán)節(jié)、多途徑作用的共同結(jié)果，通過(guò)激發(fā)生物體內(nèi)的內(nèi)在抗炎因素，提高機(jī)體免疫力從而發(fā)揮抗炎作用[18]。槲皮素、異鼠李素、皂苷類和染料木素等是槐花的主要成分，具有抗炎、抗氧化、止血、降糖、降壓、增強(qiáng)免疫力及抗腫瘤等作用[19]。但其具體藥效成分及作用機(jī)理并不完全清楚。

本研究釆用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)槐花的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路等幾個(gè)方面的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)槐花中的槲皮素可能是發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)，其次是異鼠李素、山奈酚等。研究表明，槲皮素具有抗炎[20]、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的生理活性，可通過(guò)抑制NF-κB和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而影響炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[21]；此外，槲皮素可下調(diào)脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子[22]。異鼠李素作為槲皮素的直接衍生物，多存在于沙棘中，具有良好的抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏等作用[23]，而其延緩LPS炎癥作用是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[24]。山奈酚具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[25]。β-谷甾醇與阿司匹林聯(lián)合使用比單獨(dú)使用阿司匹林的抗炎效果更強(qiáng)[26]。說(shuō)明槐花可能通過(guò)多成分聯(lián)合作用發(fā)揮抗炎活性。

通過(guò)槐花中多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用于炎癥代謝多個(gè)途徑及炎癥發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過(guò)程分析顯示，槐花抗炎作用主要涉及細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、抑制因子、趨化因子、蛋白(血管細(xì)胞黏附蛋白、急性相蛋白、E選擇素、熱休克蛋白、生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白等)、酶等152個(gè)靶點(diǎn)。其中IL10是主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，限制炎癥引起的過(guò)度組織破壞[27]。IL2可活化T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，同時(shí)能增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能，間接發(fā)揮抗炎作用[28]。VCAM1是一種重要的細(xì)胞黏附因子，參與細(xì)胞的增殖分化等[29]。STAT1主要通過(guò)激活I(lǐng)FN參與表達(dá)細(xì)胞增殖分化相關(guān)的基因，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，清除病原體[30]。NOS2是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，能促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生，作為炎癥介質(zhì)廣泛參與炎癥、哮喘等疾病的病理發(fā)展過(guò)程[31]。CXCL10是一種趨化因子，參與周圍免疫細(xì)胞的趨化、分化和激活、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、凋亡和血管抑制效應(yīng)的調(diào)節(jié)等多種過(guò)程[32]。CHUK絲氨酸激酶在NF-κB信號(hào)負(fù)反饋中發(fā)揮關(guān)鍵作用，限制炎癥基因的激活[33]。由此可見(jiàn)，槐花可能通過(guò)作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)其抗炎目的。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)槐花抗炎關(guān)鍵靶標(biāo)基于生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行GO功能分析，顯示這些靶標(biāo)主要分布在細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)、膜結(jié)合囊泡、核周區(qū)域等部位，與蛋白、脂肪酸、受體結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白激酶的活性，參與機(jī)體對(duì)多種物質(zhì)刺激的反應(yīng)過(guò)程。如可能參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、正調(diào)控轉(zhuǎn)錄DNA模板、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、藥物反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控和對(duì)LPS反應(yīng)等作用。

對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路為槐花抗炎的關(guān)鍵通路。TNF是一種重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括凋亡、細(xì)胞存活及炎癥和免疫。TNFR1幾乎在所有細(xì)胞中表達(dá)，是TNF(也稱為TNF-α)的主要受體[34]，通過(guò)NF-κB途徑和MAPK級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)許多基因的激活，調(diào)控細(xì)胞凋亡和壞死[35]。TNFR2可在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，是TNF和LTA(也稱為TNF-β)的受體[36]。Toll樣受體是一種模式識(shí)別受體，其MyD88依賴途徑通過(guò)快速激活NF-κB和MAPK產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[37]，而MyD88獨(dú)立途徑通過(guò)誘導(dǎo)IFN-β基因，緩慢激活NF-κB和MAPK誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟[38]。NOD樣受體是特定的模式識(shí)別受體，識(shí)別各種病原體并產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)。NOD1和NOD2是2個(gè)典型的NLR，能驅(qū)動(dòng)NF-κB和MAPK的激活，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和凋亡[39]。不同的NLR通過(guò)炎癥小體的多蛋白復(fù)合物的組裝誘導(dǎo)Caspase-1激活[40]，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL1β、IL18的成熟并驅(qū)動(dòng)焦亡[41]。以上分析表明槐花可能通過(guò)多層次、多途徑實(shí)現(xiàn)抗炎作用，但其具體的抗炎機(jī)制仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，槐花通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路參與機(jī)體抗炎的反應(yīng)過(guò)程。該分析為闡明其抗炎成分及作用機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，為槐花的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。