席 靜，易繼海，王月麗，徐朕宇，李培東，張江偉，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，石河子 832000)

牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)是導致犢牛腹瀉的主要病原之一，該病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的雙股RNA病毒，電鏡下觀察可見典型的“車輪狀”，直徑60～80 nm[1-2]。1968年Mebus等[3]用電鏡首次從犢牛腹瀉糞便中發(fā)現(xiàn)了BRV，證明該病毒是引發(fā)犢牛腹瀉的主要病原，命名為NCDV株。隨后,很多國家都發(fā)現(xiàn)了由BRV引起的犢牛腹瀉。直到1980年吳城等[4]證實中國牛群中也存在BRV。BRV感染多發(fā)生于1月齡以內的犢牛，發(fā)病率為90%～100%，病死率最高可達50%，成年牛多呈隱性感染，該病毒還易與細菌或其他病毒混合感染，導致病情惡化、死亡率升高[5-6]。

輪狀病毒由核心蛋白層、內層衣殼和外層衣殼組成。依據(jù)中間衣殼蛋白(VP6)抗原和基因的相似性，可將輪狀病毒分為7個血清群(A～G群)，其中A群是引起幼齡動物腹瀉最常見的抗原群[7-8]。依據(jù)細胞的蛋白酶敏感蛋白(VP4)和糖蛋白(VP7)的抗原性和基因的相似程度性，可將A群輪狀病毒進一步分為P型和G型，目前已有27個G型和35個P型[9]，而中國G6、G10和P[1]、P[5]、P[11]基因型最常見，且中國已陸續(xù)分離到BRV G6P[5][10-11]、G10P[11][12-13]、G8P[1][14]及G6P[1][15-16]基因型。

輪狀病毒具有變異快、基因型復雜的特點，異源與同源毒株之間均可通過重配、重排產生新毒株，甚至擴大宿主范圍[17-18]。BRV的基因重組不僅會在同一物種之間發(fā)生，不同物種之間也會發(fā)生，從而導致BRV基因具有多樣性[19]。這種現(xiàn)象也對BRV疫苗的研發(fā)和臨床應用造成了嚴重的阻礙與挑戰(zhàn)。因此，本研究對BRV進行分離鑒定并分析流行毒株的基因型，以期為局部地區(qū)BRV遺傳演化、疫情防控及疫苗的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細胞 于新疆北疆某規(guī)模牛場隨機采集15份腹瀉新生犢牛的糞便樣品。Marc-145細胞(CL-0566)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。BRV陽性血清由石河子人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 Rota-Corona-k99抗原檢測試劑盒(IDEXX公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、TRIzol、DNA Marker、瓊脂糖、Triton、5% BSA封閉液、山羊抗牛IgG-FITC、2%磷鎢酸負染色液(北京索萊寶科技有限公司)；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和cDNA反轉錄試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)；1×PBS、DMEM培養(yǎng)液、Hank’s液、4%多聚甲醛組織固定液(Biosharp公司)。

超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱、微量移液器、PCR儀(Thermo公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)；銅網碳支持膜(北京中鏡科儀技術有限公司)。

1.2 病料處理及檢測

將采集的糞便樣品使用Rota-Corona-k99抗原檢測試劑盒進行檢測。取抗原陽性的樣品加入pH 7.4的PBS制成20%糞便懸液，充分振蕩混勻，反復凍融3次后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，在超凈工作臺中取上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌并分裝至1.5 mL EP管內，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離培養(yǎng)

取處理過的病毒液，加入終濃度為20 μg/mL的胰蛋白酶，放置37 ℃培養(yǎng)箱活化1 h。接種于用Hank’s液清洗過的單層Marc-145細胞中，再放回37 ℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h后棄上清。加入含終濃度為5 μg/mL胰蛋白酶的無血清DMEM，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，同時設置不接種病毒液的陰性對照。收集細胞及培養(yǎng)液，反復凍融3次離心取上清液，按上述方法繼續(xù)盲傳直至出現(xiàn)明顯細胞病變效應(CPE)，當CPE>80%時收毒，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒間接免疫熒光試驗(IFA)和電鏡觀察

將Marc-145細胞提前24 h鋪于6孔板中，待細胞匯合度達到80%時，將-80 ℃保存的病毒液反復凍融3次后接種于Marc-145細胞中，同時設置不接種病毒液的陰性對照。37 ℃培養(yǎng)48 h后，棄去上清液；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS清洗3遍；加入1 mL 0.1% Triton通透破膜10 min，PBS清洗3遍；加入1 mL 5% BSA放置37 ℃培養(yǎng)箱封閉1 h，PBS清洗3遍；以BRV陽性血清(1∶50)為一抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3遍；以山羊抗牛IgG-FITC(1∶100)為二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3遍后棄去板內所有液體，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照保存。

將凍融3次的病毒液50 000 r/min 高速離心濃縮，取10 μL病毒液滴至銅網碳支持膜上，加入10 μL 2%磷鎢酸負染色液進行負染，經透射電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.5 病毒分型基因的克隆

參考NCBI中公布的BRV的VP6和VP7基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TRIzol Reagent法提取病毒分離株的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL：cDNA模板2 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化目的條帶，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物信息

1.6 基因序列分析

將VP6和VP7基因測序結果分別在NCBI中進行BLAST比對，選取參考毒株基因，用DNAStar軟件的Clustal Ⅴ方法進行核苷酸序列相似性分析，并運用Mega 6.0軟件繪制基因遺傳進化樹。

2 結 果

2.1 病毒分離培養(yǎng)

Rota-Corona-k99抗原檢測試劑盒結果顯示，有3份樣品呈BRV抗原陽性，將陽性樣品經處理后分別接種于Marc-145細胞，僅有1份樣品盲傳至第5代時出現(xiàn)不明顯的CPE，傳至第9代CPE穩(wěn)定且明顯。正常Marc-145細胞呈扁平不規(guī)則的多邊形，形態(tài)清晰，24 h即可長成致密單層(圖1A)。將病毒液接種于Marc-145細胞，36 h時出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為胞漿相連、拉網、邊界不清晰并伴隨細胞空斑的形成(圖1B)；72 h時CPE更明顯，細胞皺縮脫落、細胞間質顆粒增多(圖1C)。表明從腹瀉犢牛的糞便樣品中成功分離獲得了1株使細胞產生CPE的毒株。

A，正常Marc-145細胞；B，接種病毒液36 h時CPE；C，接種病毒液72 h時CPE

2.2 分離株IFA和電鏡觀察

IFA檢測結果顯示，不接種病毒液的Marc-145細胞未見熒光(圖2A)，接種病毒液的Marc-145細胞胞漿內有亮綠色的熒光(圖2B)，初步確定抗原為BRV。電鏡觀察結果顯示，該病毒形態(tài)呈球形、無囊膜，有經典的“車輪狀”，直徑約65 nm(圖3)。由此確定獲得的分離株為BRV，并命名為XJ-2022。

A，正常Marc-145細胞；B，感染病毒液的Marc-145細胞

圖3 分離株電鏡觀察結果(20 000×)

2.3 VP6和VP7基因PCR擴增

用特異性引物對XJ-2022分離株進行PCR擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳可獲得與預期大小的目的條帶(圖4)。經過序列測定，獲得1 356 bp的VP6全基因序列及342 bp的VP7部分基因序列。

M,Super DNA Marker；1、3，陰性對照；2，VP6基因；4，VP7基因

2.4 VP6基因相似性比對和進化樹分析

用DNAStar軟件的Clustal Ⅴ方法，將XJ-2022株VP6基因的核苷酸序列與其他參考毒株進行相似性比對，結果顯示,XJ-2022株VP6基因與參考株DB2015-066(LC367318.1,泰國/2015,人,A群)相似性最高,為98.4%；其次是參考株A44(LC133573.1,泰國/1989，牛，A群)、61A(LC133540.1,泰國/1989，牛，A群)和22R(AB040055.1,日本/2003，牛，A群)，相似性為95.5%；與其他A群參考株核苷酸相似性均≥95%(圖5)。遺傳進化樹顯示，XJ-2022分離株與參考株DB2015-066(LC367318.1,泰國/2015，人，A群)聚為一小分支，與其他A群輪狀病毒雖在一個大的分支上，但在遺傳進化上仍存在一定距離(圖6)。表明XJ-2022株VP6基因型為A群輪狀病毒。

圖5 XJ-2022株與其他輪狀病毒參考毒株VP6基因核苷酸序列相似性比對

圖6 XJ-2022株與其他輪狀病毒基于VP6基因的進化樹

2.5 VP7基因相似性比對和進化樹分析

將XJ-2022株VP7基因的核苷酸序列與其他參考毒株進行相似性比對，結果顯示，XJ-2022株VP7基因和參考株XJX2(MN937506.1,中國/2018，牛，G10型)和61A(LC133541.1,泰國/1989，牛，G10P[5]型)相似性最高,為98.1%；其次是參考株A44(LC133574.1,泰國/1989，牛，G10P[11]型)和1254(JN007406.1,意大利/2005，牛，G10型),相似性為97.5%；與HY-13(MK638905.1,中國/2017，耗牛，G10型)相似性為97.1%；與其他G10型輪狀病毒核苷酸相似性均>93%(圖7)。遺傳進化樹顯示，XJ-2022分離株與參考株XJX2(MN937506.1，中國/2018，牛，G10型)聚為一小分支，與61A(LC133541.1，泰國/1989，牛，G10P[5]型)聚為一個次級分支，與其他G10型輪狀病毒在遺傳進化上存在一定距離(圖8)。表明XJ-2022株VP7基因型為G10型輪狀病毒。

圖7 XJ-2022株與其他輪狀病毒參考毒株VP7基因核苷酸序列相似性比對

圖8 XJ-2022株與其他輪狀病毒基于VP7基因的進化樹

3 討 論

輪狀病毒侵入細胞時主要通過胞漿膜直接進入胞漿，穿入細胞膜依賴于外層衣殼蛋白VP4，而VP4蛋白需在胰蛋白酶作用下裂解為VP5和VP8 2個亞基，VP5能增加細胞膜的滲透性，VP8使病毒吸附于細胞表面，進而提高輪狀病毒侵入效率。而VP7蛋白具有穩(wěn)定VP4結構的作用可與細胞受體結合，加速輪狀病毒侵入細胞[8,20]。然而除A群輪狀病毒能在體外進行細胞培養(yǎng)外,其他毒株迄今還未在體外培養(yǎng)成功,只能通過感染易感動物來分離和復制病毒[6]。輪狀病毒的細胞培養(yǎng)主要依附于胰蛋白酶處理適應細胞[21-22]。牛源輪狀病毒的分離比其他物種相對容易,但仍需用胰蛋白酶處理病毒及維持液中加入低濃度胰蛋白酶增加病毒對細胞的易感性[22]。而不同毒株對胰蛋白酶的敏感性也不相同，在病毒分離時所加入胰蛋白酶終濃度和活化接種時間需根據(jù)毒株進一步摸索驗證。

本研究采用Marc-145細胞對BRV進行體外細胞分離。維持液中胰蛋白酶終濃度摸索過1、3、5和10 μg/mL，其中1、3 μg/mL胰蛋白酶在接種后第6代也未出現(xiàn)CPE，經PCR擴增發(fā)現(xiàn)分別從第2和4代后未出現(xiàn)目的條帶。而用10 μg/mL胰蛋白酶接種后24 h細胞基本脫落死亡。本研究用維持液的胰蛋白酶終濃度5 μg/mL，盲傳9代后分離出BRV。表明高濃度的胰蛋白酶會對病毒和細胞造成一定程度的傷害，但胰蛋白酶濃度過低也會降低病毒的感染性造成病毒在傳代中丟失。

輪狀病毒的基因重配是其進化的主要方式，具有變異快、基因型復雜的特點，異源毒株與同源毒株之間均可通過重配、重排產生新毒株，甚至擴大宿主范圍[11]。目前已有文獻顯示，人、牛、豬輪狀病毒均有基因重配現(xiàn)象的發(fā)生[18]。2013年Park等[23]從韓國腹瀉牛群中分離到的30株G6、G8型BRV，經相似性分析發(fā)現(xiàn)其中有1～9個基因片段來源于人或豬。同年Ghosh 等[24]從日本分離的馬源輪狀病毒(OH-4)，其中VP7、VP4、VP3、NSP1、NSP3和NSP5基因均來自于牛源輪狀病毒。2021年曹存等[11]從黑龍江腹瀉犢牛中分離的BRV(DZ株)，其中VP1、VP4、VP6、NSP2和NSP4基因與牛、人、犬和山羊來源的基因序列相似性最高，為多元重配病毒，再一次證實了基因重配在輪狀病毒進化和種間傳播上的作用。本研究分離的XJ-2022株VP6基因與泰國人源A群輪狀病毒DB2015-066(LC367318.1)相似性最高且遺傳進化親緣關系最近，與其他A群參考株遺傳進化相對較遠，而VP7基因卻與中國牛源G10型輪狀病毒XJX2(MN937506.1)相似性最高且遺傳進化親緣關系最近。以上結果表明XJ-2022株是人和牛多元重配病毒，其基因型為A群G10型輪狀病毒。2008年常繼濤等[12]和2019年張迎春等[25]已從新疆腹瀉犢牛糞便中分離到BRV G10型基因，進一步證實G10型BRV為新疆主要的流行株。而XJ-2022株則是首次從新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的多宿主來源的基因重配病毒，也進一步證實輪狀病毒的不同節(jié)段在種間和種內均可交換，形成新基因型的輪狀病毒。

4 結 論

本研究成功分離到基因型為A群G10型的BRV XJ-2022株，該分離株為新疆地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的多宿主來源的基因重配病毒，為新疆BRV的遺傳進化及分子流行病學研究奠定基礎，也為BRV疫苗研究提供候選毒株。