張 薇，武 華，陰雅潔，李松勵，侯紹華

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，保定 071000)

新型鴨呼腸孤病毒病是由新型呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染番鴨、半番鴨和北京鴨等多品種鴨引起的一種以肝臟和脾臟出現(xiàn)腫大壞死、出血為主要病理變化的一種免疫抑制性鴨傳染病[1]。自2017年以來，該病在中國多地鴨場相繼暴發(fā)，與以往報道的鴨呼腸孤病毒相比，NDRV的致病性更強，宿主范圍更廣，死亡率更高，給中國養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[2-4]。NDRV屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，粒子直徑為70～80 nm，基因組由10個節(jié)段的雙鏈RNA組成[5-6]。NDRV σC蛋白由S1基因編碼，是病毒外衣殼的次要成分，是病毒結合細胞受體的作用位點，能夠誘導宿主產(chǎn)生中和抗體[7-8]。對水禽源呼腸孤病毒的研究表明，外衣殼蛋白(μB、σB和σC)編碼基因的序列變異性顯著高于其他基因節(jié)段，σC蛋白編碼基因節(jié)段的變異性最高，因此，σC基因更適合于不同毒株的鑒別[9]。

目前，國內(nèi)外鮮有預防和治療NDRV的生物制品[10]。盡管抗禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)和番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)的疫苗可以降低呼腸孤病毒感染的風險，但NDRV與禽呼腸孤病毒、番鴨呼腸孤病毒抗原是否有交叉保護，相關禽呼腸孤病毒和番鴨呼腸孤病毒的疫苗能否有效預防新型鴨呼腸孤病毒病，有待進一步研究。由于呼腸孤病毒科的核酸屬于多節(jié)段基因，以及RNA聚合酶缺乏校正功能，導致病毒容易發(fā)生基因重組或抗原變異，產(chǎn)生新的致病性毒株，呼腸孤病毒的這個特性為研制有效的疫苗提出了挑戰(zhàn)[11]。因此，NDRV的分離與鑒定對疫苗毒株候選苗的篩選具有重要意義。為了掌握病毒病原特點及遺傳進化規(guī)律，本研究從河北某鴨場采集疑似NDRV感染病鴨的肝臟和脾臟，通過RT-PCR、透射電鏡觀察、間接免疫熒光法(IFA)鑒定病毒，并對分離得到的病毒進行σC基因測序和遺傳進化分析，以確定病毒來源及進化規(guī)律，以期為新型鴨呼腸孤病毒病的防控和疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 10份肝臟和脾臟病料采自河北某養(yǎng)殖場的疑似NDRV感染的鴨。

1.1.2 雞胚、細胞、試驗動物 10枚9日齡SPF雞胚(北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司)；雞肝癌細胞(LMH)和倉鼠腎成纖維細胞(BHK)(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存)。10只7日齡北京鴨(北京南口北京鴨育種中心)。

1.1.3 主要試劑及儀器 AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒(北京三博志業(yè)生物技術有限公司)；EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix (+dye)、Trans2K?Plus DNA Marker(北京全式金生物技術有限公司)；50×TAE(北京萃鋒科技有限公司)；瓊脂糖(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)；特級胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、青-鏈霉素(北京中創(chuàng)宏達科技有限公司)；F12培養(yǎng)基(北京依珊匯通科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)；NDRV陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室制備并保存。FITC-兔抗鴨IgY IgG(H+L)(蘇州博特龍免疫技術有限公司)；Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司)；DAPI Fluoromount-GTM 抗熒光淬滅封片劑(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)。透射電子顯微鏡(型號：HT770)；激光共聚焦顯微鏡(型號：TCS SP8)。

1.2 病料的處理

剖檢發(fā)病鴨可見肝臟和脾臟出現(xiàn)壞死，出血，采集肝臟和脾臟，剪碎并研磨，與生理鹽水按照1∶5的比例用勻漿機制成勻漿，加入1 000 IU青霉素、鏈霉素處理12 h后，―80 ℃反復凍融3次，8 000 r/min離心20 min，取上清無菌分裝，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒的分離及鑒定

1.3.1 病毒的分離 將上述過濾后的病毒上清液經(jīng)尿囊腔無菌接種9日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，并用等量的加有雙抗的生理鹽水作為陰性對照，37 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察2次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，連續(xù)觀察5 d，收集死亡雞胚，4 ℃展示柜放置過夜，觀察剖檢死亡雞胚，在雞胚上連續(xù)傳3代，無菌收獲雞胚和尿囊液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒的血凝特性鑒定 對收獲的第3代雞胚尿囊液參照《中華人民共和國獸藥典》[12]進行血凝試驗，以新城疫病毒為陽性對照。具體步驟如下：在96孔微量板上，從第1至10孔，每孔加入PBS 25 μL，隨后吸取第3代雞胚尿囊液25 μL，從第1孔起，依次做2倍系列稀釋(稀釋度依次為1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶26、1∶27、1∶28、1∶29、1∶210)。每孔加入1%雞紅細胞25 μL，并設不加第3代雞胚尿囊液的紅細胞為對照，立即在微量板振搖器上搖勻，室溫靜置30 min，傾斜96孔微量板，觀察分離株是否能凝集雞紅細胞。

1.3.3 病毒PCR鑒定 根據(jù)GenBank上已公布的NDRV σC基因序列(登錄號：KJ879930.1)，選擇保守區(qū)域運用Oligo 7.0設計NDRV特異性檢測引物，引物序列：F：5′-ATCAAATCCCTCC-AAAGC-3′；R：5′-CAGCCATAAAGGAAGCAG-3′，預期擴增片段大小為727 bp。引物由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。根據(jù)AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書提取第3代雞胚尿囊液中病毒RNA，以RNA為模板，RNase-free ddH2O代替RNA模板作為陰性對照，利用EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix (+dye)進行RT-PCR擴增。PCR反應體系20 μL：RNA模板5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×ES One-Step Reaction Mix 10 μL，EasyScript?One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，RNase-free ddH2O補至20 μL。PCR反應程序：45 ℃孵育30 min；94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸42 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時，參考李靜[13]禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨瘟病毒(DPV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)的引物對上述提取的第3代雞胚尿囊液中的病毒RNA進行PCR檢測。

1.3.4 病毒純化及電鏡觀察 將第3代雞胚尿囊液4 ℃、8 000 r/min離心1 h，取上清，4 ℃ 32 000 r/min離心3 h，棄上清，用少量PBS重懸沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清，即為純化的病毒液，用3%磷鎢酸負染后通過透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)及大小。

1.3.5 病毒的間接免疫熒光鑒定 將BHK細胞培養(yǎng)于放有爬片的24孔板中，長滿單層后接種第8代病毒液，以不接種病毒液為陰性對照，當接種病毒液的細胞出現(xiàn)明顯病變時，用適量4%多聚甲醛覆蓋細胞室溫固定15 min，PBS洗3遍，在冰上用0.1% Triton X-100孵育15 min透化細胞，PBS洗3次，用5% BSA孵育1 h，加入NDRV陽性血清(1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入FITC標記的兔抗鴨IgY IgG(H+L)(1∶1 000稀釋)37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，最后取細胞爬片倒放于滴有抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)的載玻片上進行封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 病毒的體外細胞培養(yǎng)

取經(jīng)PCR鑒定為NDRV陽性并純化的病毒液分別接種BHK和LMH細胞，每12 h觀察1次，繼續(xù)培養(yǎng)3 d或當細胞病變達到70%～80%時收獲病毒，反復凍融3次，連續(xù)盲傳8代，同時設正常細胞作為陰性對照，觀察病毒增殖產(chǎn)生的細胞病變。

1.5 動物回歸試驗

將1.3.1中無菌收獲的雞胚，按照1∶5(W/V)的比例加入生理鹽水制成勻漿，用青-鏈霉素處理12 h，―80 ℃反復凍融3次，8 000 r/min離心1 h，取上清用0.22 μm濾器過濾除菌。將10只7日齡健康雛鴨分為試驗組和對照組，每組5只。試驗組皮下接種純化的病毒(1 mL/只)，對照組注射等體積生理鹽水。隔離飼養(yǎng)7 d，每天觀察雛鴨發(fā)病情況，接種后第7天全部處死，剖檢觀察其肝臟和脾臟的病理變化。

1.6 病毒σC基因的擴增與序列分析

根據(jù)GenBank上NDRV σC基因序列(登錄號：KJ879930.1)，選擇兩端保守區(qū)域設計擴增σC基因完整開放閱讀框(ORF)的特異性引物，引物序列為：F：5′-ATGGATCGCAACGAGGTGA-3′;R：5′-ATGAA-TAGCTCTTCTCATCGC-3′，預期擴增片段大小為997 bp，引物由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。提取第3代雞胚尿囊液RNA，以RNase-free ddH2O代替RNA模板作為陰性對照，參照1.3.3 RT-PCR擴增體系和擴增程序進行擴增，用膠回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物，連接pMD19-T克隆載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取菌落進行PCR鑒定后將陽性菌株送至蘇州金唯智生物技術有限公司測序。利用Mega 7.0對NDRV σC基因與GenBank中已發(fā)表的其他NDRV σC基因序列進行遺傳進化分析和相似性比對。同時比對分離株與滅活疫苗TH11株(KC493571.1)和弱毒疫苗JS01-105P株(V202168)σC蛋白氨基酸序列并進行分析。

2 結 果

2.1 病毒的分離

由圖1可知，雞胚在接毒后出現(xiàn)死亡，死亡雞胚全身出血，充血嚴重，有彌散針尖樣出血點，剖檢病變可見肝臟出血腫大，脾臟有出血點。

A、B，正常雞胚；C、D，死亡雞胚；E，死亡雞胚的脾臟

2.2 病毒的血凝特性鑒定

由圖2可知，NDRV分離株反應孔均呈線狀流下，陽性對照反應孔呈完全無線狀流下(100%凝集)的最高稀釋倍數(shù)為1∶24，即血凝效價為1∶24，該NDRV分離株對雞紅細胞不具有血凝活性。

圖2 NDRV分離株血凝特性的測定

2.3 病毒PCR鑒定

病料上清液PCR鑒定結果顯示，在約727 bp處可見NDRV條帶，與預期大小一致，禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎、鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、禽腺病毒血清4型檢測結果均為陰性(圖3)。說明成功分離NDRV，命名為BD/CHN/2020。

M，DL5000 DNA Marker；1，NDRV；2，陰性對照；3，禽呼腸孤病毒；4，鴨病毒性肝炎病毒；5，鴨坦布蘇病毒；6，鴨瘟病毒；7，禽腺病毒4型

2.4 病毒的透射電鏡鑒定

由圖4可知，病毒經(jīng)3%磷鎢酸染色后，透射電鏡觀察可見直徑為60～80 nm、無囊膜、球形的病毒粒子，與NDRV形態(tài)和大小相符。

圖4 BD/CHN/2020株透射電鏡觀察結果(40 000×)

2.5 病毒的間接免疫熒光鑒定

由圖5可知，接種BD/CHN/2020株的BHK細胞在細胞質顯現(xiàn)特異性綠色熒光，未接種BD/CHN/2020株的BHK細胞無特異性綠色熒光。說明病毒感染BHK細胞后能夠表達相關蛋白。

圖5 BD/CHN/2020株間接免疫熒光檢測結果(200×)

2.6 病毒的體外細胞培養(yǎng)

由圖6可知，BD/CHN/2020株接種BHK細胞傳至第5代后，48 h出現(xiàn)明顯細胞病變，細胞聚集成團，形成大量的合胞體，然后細胞逐漸拉網(wǎng)脫落；接種LMH細胞傳至第2代后，72 h出現(xiàn)明顯細胞病變，細胞圓縮、聚集，形成合胞體。

A，BD/CHN/2020株接種BHK細胞盲傳至第5代，接種48 h；B，BD/CHN/2020株接種LMH細胞盲傳至第2代，接種72 h；C，正常BHK細胞培養(yǎng)48 h；D，正常LMH細胞培養(yǎng)72 h

2.7 動物回歸試驗

將過濾除菌的雞胚上清液皮下注射7日齡健康的北京鴨，接種后第2天發(fā)病鴨精神沉郁，眼周濕潤、淚痕明顯，排白色稀糞，至第7天5只全部發(fā)病，死亡3只。試驗組發(fā)病率為100%，死亡率為60%。由圖7可知，剖檢死亡鴨可見脾臟腫大、呈暗紅色，有大小不一的白色壞死灶，部分出現(xiàn)肝臟腫大，有白色壞死灶和出血斑。對照組肝臟和脾臟無明顯病變。

圖7 BD/CHN/2020株感染雛鴨脾臟和肝臟剖檢病變

2.8 病毒σC基因的擴增與序列分析

由圖8可知，第3代雞胚尿囊液經(jīng)RT-PCR擴增，在約997 bp處得到單一σC基因條帶，與預期大小一致。利用Mega 7.0將本研究分離的BD/CHN/2020株與GenBank中其他已發(fā)表的禽源呼腸孤病毒毒株進行σC基因的遺傳進化分析，由圖9和表1可知，NDRV σC基因核苷酸系統(tǒng)進化樹分為2大進化分支，雞源支和水禽支，BD/CHN/2020株與NDRV不同毒株在同一分支，相似性高達92.9%～99.7%，其中與NDRV SY親緣關系最近，相似性達99.7%，而與番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒相似性較低，分別為52.0%～53.5%、27.0%～27.6%；BD/CHN/2020株與滅活疫苗TH11株和弱毒疫苗JS01-105P株相比，與滅活疫苗TH11株核苷酸相似性為98.2%，而與弱毒疫苗JS01-105P株相似性略低，為97.7%。經(jīng)σC蛋白氨基酸相似性比對，BD/CHN/2020株與其他NDRV參考株相似性為86.0%～97.7%。由表2可知，與TH11株相比，BD/CHN/2020株第93位氨基酸由S變?yōu)門，第132位氨基酸由T變?yōu)锳，第158位氨基酸由Q變?yōu)镠，第253位氨基酸由V變?yōu)锳，第298位氨基酸由A變?yōu)閂，與JS01-105P株相比，BD/CHN/2020株第120位氨基酸由P變?yōu)門。

M，DL5000 DNA Marker；1，第3代雞胚尿囊液；2，陰性對照

圖9 基于NDRV σC基因核苷酸序列的遺傳進化樹

表1 σC基因核苷酸和氨基酸序列相似性比對

表2 BD/CHN/2020株氨基酸突變位點

3 討 論

NDRV由于其高致病性和廣泛的宿主譜而嚴重損害了水禽業(yè)，該病毒最早發(fā)現(xiàn)于南方，近幾年中國北方地區(qū)相繼有關于新型鴨呼腸孤病毒病的報道，感染鴨早期無明顯特異性癥狀，剖檢特征性病變?yōu)槠⑴K出血或壞死，耐過病鴨生長發(fā)育緩慢[14-16]。因此,了解NDRV的病原學和流行病學對于控制該病發(fā)生十分重要。本研究通過PCR、透射電鏡觀察、間接免疫熒光法鑒定，并對分離毒株進行了σC基因的測序和遺傳進化分析，以了解其病原學特性和流行情況。在病毒的分離試驗中，BD/CHN/2020株對SPF雞胚有致病性，且能引起與鴨感染NDRV相似的病理變化，與劉曉麗等[17]報道一致，提示BD/CHN/2020株有垂直傳播感染雞群、導致雛雞免疫抑制的可能。因此，在實際的養(yǎng)殖過程中，尤其是種雞場、孵化場，要防止鴨呼腸孤病毒對雞胚的污染，切斷傳播途徑，預防雞群感染鴨呼腸孤病毒的可能性。最先采用BHK細胞進行病毒培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該毒株在BHK細胞上適應5代以上才能產(chǎn)生細胞病變，這可能會導致毒力減弱或基因突變，基于此，嘗試采用LMH細胞進行病毒分離培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，傳至第2代即出現(xiàn)明顯的細胞病變，建立了NDRV低代次分離培養(yǎng)的方法，為其病原學特性的評價奠定基礎。動物回歸試驗結果表明，攻毒鴨全部發(fā)病，剖檢后發(fā)現(xiàn)與鴨場發(fā)病鴨相似的病理變化，主要表現(xiàn)為脾臟腫大壞死出血，部分肝臟出現(xiàn)腫大，有白色壞死灶和出血斑，與Farkas等[3]報道的以肝臟和脾臟表面有針頭大的白色壞死點為病理特征的番鴨呼腸孤病毒有所不同，與武鴻等[18]報道的以脾臟腫大、壞死，呈暗紅色為主要病變的NDRV分離毒株一致，更符合NDRV的病理變化。BD/CHN/2020株可能與南方NDRV的傳播密切相關，NDRV最早發(fā)生于南方，北方較南方少，近幾年NDRV流行范圍從南方擴散到北方，北方多地相繼出現(xiàn)NDRV感染的報道[19]，遺傳進化分析結果顯示，該毒株與NDRV不同毒株在同一分支，與2018年由晁錦等[20]在江蘇省沭陽某發(fā)病鴨場分離得到的NDRV SY株核苷酸序列相似性最高，為99.7%，所以推測BD/CHN/2020株的出現(xiàn)可能與南方NDRV的傳播有關。

σC蛋白是病毒外衣殼的次要成分，能夠誘導機體產(chǎn)生保護性中和抗體，σC蛋白作為病毒結合細胞受體的主要位點，對病毒的吸附、合胞體的形成有重要影響，并促進病毒的侵襲[21-22]。目前商品化的鴨呼腸孤病毒病疫苗僅有番鴨呼腸孤病毒活疫苗(CA株)，對NDRV σC基因序列分析顯示，BD/CHN/2020株與番鴨呼腸孤病毒核苷酸序列相似性為52.0%～53.5%，相似性較低，在免疫過程中產(chǎn)生的中和抗體可能會有所不同，導致番鴨呼腸孤病毒活疫苗(CA株)對NDRV保護不完全，其他NDRV疫苗還處于試驗研究階段。比對BD/CHN/2020株與滅活疫苗TH11株(KC493571.1)和弱毒疫苗JS01-105P株(V202168)σC氨基酸序列均發(fā)生了突變，有文獻表明2017年及以后的NDRV分離株在σC氨基酸位點132A、138R、158H和258A處存在特異性突變[23]，NDRV分離株可能正在不斷的變異和進化，BD/CHN/2020株與2011年發(fā)現(xiàn)的TH11株(KC493571.1)相比發(fā)生了5個氨基酸突變位點中132A、158H印證了這一點。σC蛋白氨基酸位點的突變有可能改變病原的感染能力，從而引起病原的抗原發(fā)生變異，引起疫苗保護不完全的問題。因此，應加強對NDRV的流行情況和病原特點的掌握、早期落實綜合防治措施和改善養(yǎng)鴨管理制度、研發(fā)新疫苗等，控制該病的暴發(fā)和流行，使中國養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。

4 結 論

本研究成功分離得到1株NDRV，其可在BHK、LMH細胞上穩(wěn)定增殖產(chǎn)生細胞融合病變并致死雞胚，感染雛鴨后產(chǎn)生典型的NDRV病理變化，與國內(nèi)NDRV疫苗株相比第93、120、132、158、253和298位氨基酸處發(fā)生了突變，結果為進一步研發(fā)有效的NDRV新疫苗及其防控奠定基礎。