韓 瑞，楊 行，張文波，陳佳玲，周曉麗

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，南昌 330045)

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌感染引起的一種危害嚴重的人獸共患傳染病，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一種重要的病原體，可引起豬的敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎及人的腦膜炎[1-2]。目前豬鏈球菌的致病機制仍不清楚，普遍認為其致病力強弱主要取決于其毒力因子[3]?，F(xiàn)已報道的豬鏈球菌主要毒力因子有莢膜多糖(capsular polysaccharide,cps)、溶菌酶釋放蛋白(muraminidase-released protein,mrp)、溶血素(suilysin,sly)、胞外蛋白因子(extracellular protein factor,epf)、三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)等[4]。細菌肽聚糖水解酶(peptidoglycan hydrolase)又稱自溶素(autolysin,atl)，可通過水解細菌細胞壁的特定糖苷鍵來溶解細菌細胞壁[5]，同時與細菌的細胞壁新陳代謝、細胞分離、細胞壁翻轉(zhuǎn)、細胞壁重組和自溶等生物學特性密切相關[6-7]。除此之外，atl還與革蘭氏陽性菌的致病性有關[8]。Zhang等[9]通過體內(nèi)誘導抗原技術篩選豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2,SS2)的毒力蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從SS2的超免疫血清中檢測不到atl，但可從恢復期血清中檢測到，提示atl可能參與了細菌的致病過程。Ju等[10]也通過試驗證實atl與SS2的致病性有關。

目前，有關豬鏈球菌的檢測方法主要有生化試驗、凝集試驗、免疫印跡試驗、多重PCR等,但這些檢測方法都較費時費力或需要昂貴的儀器等，而ELISA方法具有操作簡便、經(jīng)濟、快速的特點，且該方法在中國各級獸醫(yī)檢測部門已應用多年[11]。截至目前，已有多種豬鏈球菌相關因子用于ELISA方法的建立，如gdh、mrp及分泌核酸酶(secreted nuelease A,ssnA)等[12-14]。顧宏偉等[5]通過PCR擴增臨床上27株SS2的atl基因發(fā)現(xiàn)，均有606 bp大小的條帶，證明atl基因普遍存在于SS2菌株中，具有良好的保守性，適合用于建立檢測SS2抗體的間接ELISA方法。

本研究在克隆豬鏈球菌atl基因的基礎上進行atl原核表達，以純化的重組atl蛋白為抗原，建立了檢測豬鏈球菌抗體的間接ELISA方法，以期為豬鏈球菌病的血清流行病學和防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及試驗動物 pET-32a(+)質(zhì)粒、pGEX-4T-1質(zhì)粒；豬鏈球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、不動桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、綠色氣球菌和奈瑟氏菌，大腸桿菌、綠色氣球菌和偽狂犬病病毒攻毒小鼠血清，豬鏈球菌感染陰陽性血清和不同飼養(yǎng)階段的458份豬血清樣品均由江西農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學教研室保存；60日齡體重(1±0.3) kg的雌性健康新西蘭大白兔購自江西省南昌市梅嶺養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑 T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；GST重組蛋白純化試劑盒、His重組蛋白純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自BBI公司；D2000 DNA Marker、Marker Ⅳ均購自TIANGEN公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬 IgG、4×蛋白上樣緩沖液均購自Solarbio公司；弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)均購自Sigma公司；XhoⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶均購自Thermo公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬鏈球菌atl基因(登錄號：EF127695.1)設計1對引物,引物序列為：F：5′-GCAGGATCCTCCTA-CACAGTCTATATTGA-3′；R：5′-CCGCTCGAGCTA-CTTTCCCTCAACAGCA-3′，下劃線處分別為XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切位點，預期擴增片段長度為 606 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2atl基因PCR擴增 取純化培養(yǎng)的豬鏈球菌分離菌菌液為模板，使用atl引物進行PCR擴增，PCR反應體系25 μL：2×FastTaqPremix 12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA膠回收試劑盒對目的片段進行回收，回收產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將所測基因序列與GenBank中登錄的SS2atl基因序列進行BLAST比對分析。

1.2.3 pET-32a-atl及pGEX-4T-1-atl重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 分別對質(zhì)粒pET-32a(+)、pGEX-4T-1及atl基因以BamHⅠ和XhoⅠ 進行雙酶切，回收酶切質(zhì)粒和atl基因，用T4 DNA連接酶進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆經(jīng)測序并與GenBank中登錄的SS2atl基因序列進行BLAST比對后，提取重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆作為表達菌。

1.2.4 重組表達菌的誘導表達 將活化后的1 mL重組表達菌接種含氨芐青霉素(Amp+)的200 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng) 2～3 h 后，加入 IPTG 至終濃度 1 mmol/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h，離心收集沉淀，經(jīng)PBS洗滌后，加入1 mg/mL溶菌酶并進行超聲波破碎裂解菌體，離心收集上清和沉淀，加入4×蛋白上樣Buffer，沸水浴10 min，用 SDS-PAGE 檢測表達情況。

1.2.5 融合蛋白的純化 將破碎后的含pGEX-4T-1-atl和pET-32a-atl質(zhì)粒的菌液經(jīng)離心收集上清和沉淀后，使用His標簽重組蛋白純化試劑盒、GST標簽重組蛋白純化試劑盒對重組蛋白進行純化，純化蛋白分別命名為atl-His及atl-GST融合蛋白。

1.2.6 融合蛋白的復性 將收集的包涵體形式表達的重組蛋白洗脫液用透析液A(20 mmol/L Tris-HCl，調(diào)pH 8.0)稀釋，裝入透析袋中，在4 ℃條件下依次在尿素終濃度分別為6、4、2、1 mol/L的1 L透析液A中進行透析，每12 h換液1次。隨后于透析液B(20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、2 mmol/L EDTA、0.5 mol/L尿素，調(diào)pH 8.0)中4 ℃透析12 h；于透析液C(0.2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L NaCl)中4 ℃透析12 h；用PEG8000對透析袋中液體進行濃縮，即為復性蛋白液，復性后的融合蛋白于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 多克隆抗體的制備及純化 以atl-His融合蛋白為免疫原，首免時與等量弗氏完全佐劑乳化，后面幾次免疫與等量弗氏不完全佐劑乳化，免疫新西蘭大白兔，免疫前經(jīng)耳緣靜脈采血制備血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，共進行4次免疫，每次免疫后7 d進行耳緣靜脈采血，分離血清，檢測抗體效價，最后心臟采血收集血液，分離血清，并用辛酸-硫酸銨的方法進行抗體的純化。保存于-80 ℃。

1.2.8 Western blotting 驗證atl-GST融合蛋白 將atl-GST融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，恒流200 mA，60 min。以5%脫脂奶粉封閉，封閉后以1∶10 000稀釋的抗atl兔多克隆抗體為一抗，以1∶5 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG為二抗，最終使用DAB顯色。

1.2.9 間接ELISA 方法的建立

1.2.9.1 最佳抗原包被濃度和標準血清稀釋度的確定 將atl-GST融合蛋白用PBS稀釋至12.50、10.00、7.50、5.00、2.50和1.25 μg/mL，分別按100 μL/孔，4 ℃包被過夜，傾去孔內(nèi)液體，PBS-T洗3次，拍干；以5%脫脂奶粉作封閉液，300 μL/孔，37 ℃封閉2 h，PBS-T洗3次，拍干；將豬鏈球菌陽、陰性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560稀釋，100 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS-T洗4次，拍干；加入以1∶2 000稀釋的HRP-兔抗豬IgG酶標二抗，100 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS-T洗4次，拍干；按100 μL/孔加入底物溶液，37 ℃避光顯色15 min，按50 μL/孔加入終止液終止反應，酶標儀測定D492 nm值，計算出陽性血清D492 nm值(P)與陰性血清D492 nm值(N)之比，選擇P/N最大值為抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度。

1.2.9.2 封閉時間的優(yōu)化 按照確定的條件包被抗原后，以300 μL/孔的5%脫脂奶粉封閉液，在37 ℃溫箱中分別孵育1.0、1.5、2.0和2.5 h。其余步驟按1.2.9.1方法進行，根據(jù)P/N值確定篩選出封閉時間。

1.2.9.3 血清作用時間的優(yōu)化 根據(jù)確定的條件，加入豬鏈球菌陰、陽性血清后分別作用1.0、1.5和2.0 h，其余步驟按1.2.9.1方法進行，根據(jù)P/N值確定篩選血清的最佳反應時間。

1.2.9.4 二抗作用時間和稀釋度的優(yōu)化 根據(jù)上述確定的條件，酶標抗體分別進行1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋，37 ℃溫箱中分別反應0.5、1.0和2.0 h，其余步驟按1.2.9.1方法進行，根據(jù)P/N值確定二抗最佳作用時間和稀釋倍數(shù)。

1.2.9.5 顯色時間的優(yōu)化 根據(jù)上述確定的條件，加入底物OPD進行顯色后，分別反應 10、15和20 min，用2 mol/L H2SO4終止反應，根據(jù)P/N值確定最佳顯色時間。

1.2.9.6 臨界值的確定 選取47份豬鏈球菌陰性血清，用優(yōu)化好的 ELISA 反應條件進行檢測。計算出陰性血清D492 nm值的平均值(X)和標準差(SD)；根據(jù)公式，臨界值=X+3SD，大于或等于臨界值的判斷為抗體陽性，反之則為抗體陰性。

1.2.9.7 特異性試驗 取超聲波裂解后的屎腸球菌、大腸桿菌、不動桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、綠色氣球菌和奈瑟氏菌7個菌種的裂解液，稀釋濃度為20 μg/mL包被酶標板，以純化后的抗atl兔多克隆抗體為一抗(1∶2 000稀釋)；另將atl-GST融合蛋白用PBS稀釋至5 μg/mL包被酶標板，以大腸桿菌、綠色氣球菌和偽狂犬病病毒攻毒小鼠血清作為一抗(1∶2 000稀釋)，按照優(yōu)化好的條件進行試驗，測定每孔D492 nm值，用此方法來驗證所建方法的特異性。

1.2.9.8 敏感性試驗 選取1份陽性血清自1∶40起倍比稀釋至 1∶2 560，按照優(yōu)化好的條件進行試驗，測定每孔D492 nm值，用此方法來驗證所建方法的敏感性。

1.2.9.9 重復性試驗 隨機選取 12 份(記作P1～P12)不同的血清，按確定的條件進行反應，批內(nèi)重復性試驗：選取6份血清做7個重復(同一批次的抗原包被酶標板)；批間重復性試驗：選取6份血清做4個重復(4個不同批次的抗原包被酶標板)。變異系數(shù)(%)=樣本D492 nm值的標準差(S)/樣本D492 nm值平均值×100%，用此變異系數(shù)來確定批內(nèi)和批間的重復性。

1.2.9.10 與SS2 ELISA抗體檢測試劑盒比較 利用本試驗建立的ELISA方法與武漢科前生物有限公司的SS2 ELISA抗體檢測試劑盒對實驗室保存的184份血清進行檢測，比較2種方法的符合率。

1.2.9.11 臨床樣品檢測 用建立的豬鏈球菌自溶素抗體間接 ELISA 方法檢測來自江西省部分地區(qū)的不同飼養(yǎng)階段的458份豬血清樣品，其中哺乳仔豬200份樣品，保育仔豬47份樣品，母豬185份樣品，公豬26份樣品，確定其陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 atl基因擴增及重組質(zhì)粒鑒定

從豬鏈球菌分離株中擴增到1條大小約606 bp的基因片段,經(jīng)測序和BLAST比對分析，所測基因序列與GenBank中登錄的SS2atl基因序列相似性為100%。隨機挑6個重組菌菌落進行菌落PCR，結(jié)果顯示，均可見大小約606 bp的明顯條帶(圖1)；重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-atl和pET-32a-atl經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果顯示，均獲得大小約606 bp的目的條帶(圖2)。測序及BLAST比對分析結(jié)果顯示，插入序列與atl基因序列相似性為100%。

M，D2000 DNA Marker;1～5，陽性菌落；6，陽性對照;7，陰性對照

M1，D2000 DNA Marker；1，pGEX-4T-1；2，pGEX-4T-1-atl 重組質(zhì)粒；3，pGEX-4T-1-atl BamHⅠ和 XhoⅠ 雙酶切；M2，Marker Ⅳ；4，pET-32a(+)；5，pET-32a-atl重組質(zhì)粒；6，pET-32a-atl BamHⅠ和 XhoⅠ 雙酶切

2.2 融合蛋白的誘導表達和純化結(jié)果

經(jīng)誘導表達，SDS-PAGE結(jié)果顯示，pET-32a-atl重組表達菌株在約40 ku處有明顯條帶，大小與預期相符，主要以包涵體形式表達(圖3)；pGEX-4T-1-atl重組表達菌株在約48 ku處有明顯條帶，大小與預期相符，主要以包涵體形式表達，也可以可溶性形式表達(圖4)。經(jīng)復性純化濃縮后，均獲得較高純度的融合表達蛋白。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準;1，pET-32a(+)未誘導;2，pET-32a(+)誘導;3，pET-32a-atl未誘導;4，pET-32a-atl誘導;5，pET-32a-atl裂解液上清;6，pET-32a-atl裂解液沉淀;7，pET-32a-atl純化蛋白

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準;1，pGEX-4T-1未誘導;2，pGEX-4T-1誘導;3，pGEX-4T-1-atl未誘導;4，pGEX-4T-1-atl誘導;5，pGEX-4T-1-atl裂解液上清;6，pGEX-4T-1-atl裂解液沉淀;7，pGEX-4T-1-atl純化蛋白

2.3 atl-His融合蛋白免疫兔的抗體檢測結(jié)果

對atl-His蛋白免疫4次后的兔血清進行ELISA檢測，結(jié)果顯示在血清稀釋度到達1∶32 000時，2只試驗兔仍有較高的抗體水平(圖5)。

圖5 atl-His免疫兔抗體水平

2.4 atl-GST融合蛋白的免疫原性檢測

將atl-GST融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜進行Western blotting檢測，結(jié)果在48 ku處有明顯的條帶(圖6)，與預期大小一致，表明純化的atl-GST融合蛋白具有良好的反應原性。

圖6 兔多克隆抗體Western blotting驗證結(jié)果

2.5 間接ELISA 方法的建立

2.5.1 ELISA 最佳反應條件的確定 根據(jù)P/N 值最大的原則確定最佳反應條件，由表1～6可知，atl蛋白的包被濃度為5.0 μg/mL，血清稀釋度為1∶80，5%脫脂奶粉封閉2.0 h，血清作用時間為1.0 h，酶標二抗稀釋度為1∶2 000作用30 min，OPD顯色時間10 min時效果最好。

表1 抗原包被濃度及血清稀釋度的確定(D492 nm值)

表2 封閉時間的確定(D492 nm值)

表3 血清作用時間的確定(D492 nm值)

表4 酶標二抗稀釋度的確定(D492 nm值)

表5 酶標二抗作用時間的確定(D492 nm值)

表6 顯色時間的確定(D492 nm值)

2.5.2 陰、陽性血清臨界值的確定 用上述優(yōu)化好的條件對48份豬鏈球菌陰性血清進行檢測，以確定臨界值，根據(jù)D492 nm值，計算出陰性血清的平均值(X)=0.22373，標準差(SD)=0.03126，臨界值=X+3SD=0.22373+3×0.03126=0.318。所以該方法的判定標準為：檢測樣品的D492 nm值≥0.318為陽性，D492 nm值<0.318為陰性。

2.5.3 重復性試驗 重復性試驗結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為1.65%～2.65%(表7)，批間變異系數(shù)為3.31%～8.23%(表8)，均低于10%。表明該方法具有良好的重復性。

表7 批內(nèi)重復性試驗結(jié)果(D492 nm值)

表8 批間重復性試驗結(jié)果(D492 nm值)

2.5.4 特異性試驗 以7個菌種的超聲波裂解液為抗原，純化后的抗atl兔多克隆抗體為一抗對其特異性進行驗證，結(jié)果顯示，其D492 nm值均<0.184，陽性對照D492 nm值均>1.325，表明抗atl兔多克隆抗體不與其他7種細菌的超聲波裂解液反應。以atl-GST融合蛋白為包被抗原，以大腸桿菌、綠色氣球菌和偽狂犬病病毒攻毒小鼠血清作為一抗對其進行特異性驗證，結(jié)果顯示，其D492 nm值均<0.136，其陽性對照血清D492 nm值均>5，表明攻毒小鼠血清不與atl-GST融合蛋白反應。以上試驗顯示本試驗建立的間接ELISA方法特異性良好。

2.5.5 敏感性試驗 用優(yōu)化好的條件對 1 份陽性血清稀釋后進行檢測，結(jié)果顯示，當血清 1∶1 280 稀釋時，結(jié)果仍為陽性(圖7)。表明所建立的方法敏感性較高。

圖7 敏感性試驗結(jié)果

2.5.6 與SS2 ELISA抗體檢測試劑盒比較 在檢測的184份血清樣本中，本試驗建立的間接ELISA方法檢出96份陽性，88份陰性；SS2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測出66份陽性，118份陰性。本試驗所建立的間接ELISA陽性檢出率高于SS2的商用試劑盒，其中檢測結(jié)果相符的樣本數(shù)為132份，檢測結(jié)果不符合的樣本為52份，總符合率為71.7%。

2.5.7 臨床樣本的檢測 用本試驗所建立的間接ELISA方法對來自養(yǎng)殖場的458份豬血清經(jīng)1∶80稀釋后進行檢測，結(jié)果顯示，共檢出atl抗體陽性 277份，總陽性率為60.4%，其中成年公、母豬血清樣品檢測陽性率最高，達87.5%，而哺乳仔豬和保育小豬陽性率較低，分別為37.5%和36.1%(表9)。

表9 臨床血清樣品的抗體檢測結(jié)果

3 討 論

致病性豬鏈球菌不僅嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展，也可跨物種感染人，危害公共衛(wèi)生安全。自2005年中國四川省首次發(fā)現(xiàn)豬SS2感染人后[15]，各地頻頻暴發(fā)類似疾病，江西省于2014及2019年發(fā)生豬鏈球菌感染人事件[16]。近年來，隨著限抗、替抗政策的實施和疫病流行形勢的變化，豬場的豬鏈球菌分離率也不斷增加，危害也在加劇。趙戰(zhàn)勤等[17]在2011—2015年不同地區(qū)2 521份發(fā)病豬病料組織樣品中分離到772株豬鏈球菌，占總分離細菌的30.6%，為分離率最高的細菌性病原。石大麗等[18]對2018年1～6月份廣西部分地區(qū)的疑似豬鏈球菌感染的豬組織病料進行檢測，陽性率為27.59%；沈艷玲[19]對2019—2020年江蘇某市屠宰場健康豬扁桃體進行豬鏈球菌分離和鑒定，陽性率為 51.85%；劉召穎等[20]對2020—2021 年從浙江某市屠宰場采集的健康豬扁桃體樣品進行檢測，陽性率達62.59%。因此，了解豬場豬鏈球菌的流行病學規(guī)律，對防控豬鏈球菌病有重要意義。血清流行病學調(diào)查可了解豬場疾病的分布和流行規(guī)律、疫苗免疫效果和治療效果，是傳染病流行病學調(diào)查的重要組成部分，其最常用的方法ELISA方法。目前，已建立了多種豬鏈球菌的抗體ELISA檢測方法[21]。1993年Vecht等[22]建立了雙抗夾心 ELISA 技術；張玲妮[23]利用 SS29801 株及該菌的莢膜多糖(CPS)提取物分別建立了2種間接ELISA方法，但其特異性和靈敏度均無法滿足臨床檢測；高地[24]建立了SS2免疫磁珠夾心 ELISA 檢測方法，其條件要求較高，不適合商品化應用；周明光[25]利用SS2菌株的CPS作為包被抗原建立了檢測SS2血清抗體的間接ELISA方法，臨床應用效果較好；歐瑜等[26]用MRP、EF蛋白建立了DOT-ELISA和間接ELISA 2種檢測方法；孫雯等[27]則建立了重組烯醇化酶(enolase)抗體的間接ELISA方法，對SS2感染的血清診斷有一定的應用價值。上述研究均以SS2為研究對象，應用范圍較窄。因此，建立針對致病性豬鏈球菌均能檢測的快速ELISA方法就顯得尤為重要。

atl是致病性豬鏈球菌中重要的毒力因子之一，參與豬鏈球菌的多種致病過程。顧宏偉等[5]研究結(jié)果顯示，在27株致病SS2中均可檢測到atl基因，只在1株無毒力的SS2中未檢出；而本實驗室對2019-2021年江西省規(guī)模化豬場的病死豬中分離的16株鏈球菌進行atl基因檢測和分析，10株致病性較強的SS9和1株SS1均可檢出atl基因，且序列保守性強，而其他幾株無法分型鏈球菌和非解乳糖鏈球菌中均未檢出(數(shù)據(jù)未發(fā)表)?；袅占t等[28]對肺炎鏈球菌的研究結(jié)果表明，自溶素對感染肺炎鏈球菌小鼠IgG類抗體診斷的敏感性和特異性分別為41.7%和100.0%。鄒琴等[29]利用肺炎鏈球菌自溶素建立的ELISA方法測定社區(qū)獲得性肺炎(CAP)患者血清中的抗體，結(jié)果表明，CAP患者血清標本中IgG和IgM類抗自溶素抗體滴度均高于健康對照組。據(jù)此推測，當致病性豬鏈球菌感染時，atl誘導的抗體水平會升高，而非致病性和正常作為正常菌群的鏈球菌感染，atl誘導的抗體水平一般較低。因此，atl蛋白適合用作建立豬鏈球菌抗體檢測ELISA方法的靶抗原。

本研究利用原核誘導表達、親和層析法純化豬鏈球菌atl融合蛋白，并通過條件優(yōu)化建立了檢測豬鏈球菌抗體的ELISA方法，由于目前有關豬鏈球菌 ELISA檢測的商品化試劑盒較少，所以僅與市面上的SS2 ELISA抗體檢測試劑盒進行比較分析，結(jié)果表明本研究建立的ELISA方法陽性檢出率高于SS2 商用試劑盒，其原因可能是由于本試驗建立的間接ELISA方法可檢出大多數(shù)血清型的豬鏈球菌，而SS2 ELISA抗體檢測試劑盒主要檢出SS2。對臨床豬血清進行檢測，平均陽性率為60.4%。馬昊杰[30]對2017—2019年酒泉市肅州區(qū)的SS2進行血清學調(diào)查，總陽性率為33.56%；陸亞男等[31]于2020年對上海地區(qū)種豬場的健康豬群豬進行豬鏈球菌監(jiān)測，陽性率為58.11%；賀亞楠[32]2016年對江蘇部分地區(qū)的健康豬群進行豬鏈球菌流行病學調(diào)查，陽性率為60.42%；劉琪等[33]對廣東地區(qū)健康豬群和發(fā)病豬群進行豬鏈球菌流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示發(fā)病豬群和健康豬群豬鏈球菌的陽性率分別為82.02%和42.20%；譚美芳等[34]對江西省5個規(guī)模豬場的豬鏈球菌流行情況進行調(diào)查，結(jié)果豬群的陽性率為 62.86%。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本相符，表明本研究建立的豬鏈球菌atl抗體ELISA檢測方法靈敏度較高、特異性較強，適合養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬鏈球菌血清流行病學調(diào)查和豬鏈球菌病的輔助診斷。

4 結(jié) 論

本研究利用純化的重組豬鏈球菌atl蛋白成功建立了檢測豬鏈球菌抗體的間接ELISA方法，該方法的敏感性、特異性和重復性良好；對臨床采集的豬血清進行檢測，平均陽性率為60.4%，具有較好的應用前景。