馮小品，李隱俠，張晨?jī)€，張 俊，孟春花，錢(qián) 勇，曹少先

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，南京 210014;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

多型性腺瘤基因1 (pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)屬于多形性腺瘤基因家族成員之一，是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，早期研究認(rèn)為僅可促進(jìn)多形性腺瘤的發(fā)生[1]，后來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)PLAG1能促進(jìn)脂肪母細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤等多種腫瘤的發(fā)生，其機(jī)制是PLAG1發(fā)生強(qiáng)啟動(dòng)子替換后表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)啟動(dòng)子結(jié)合上調(diào)IGF2表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與抗凋亡[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，PLAG1基因敲除小鼠胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[4]；PLAG1基因外顯子的移碼突變導(dǎo)致編碼蛋白變短后引起人胎兒出生重和身高下降[5]，提示PLAG1參與調(diào)控胎兒生長(zhǎng)發(fā)育。此外，PLAG1基因突變還與家畜的體重、體尺和屠宰性狀相關(guān)聯(lián)，湖羊PLAG1基因啟動(dòng)子區(qū)存在4個(gè)緊密連鎖位點(diǎn)，且與出生體重和斷奶體重均顯著相關(guān)[6]；牛PLAG1基因鄰近區(qū)域的1個(gè)數(shù)量性狀核苷酸序列(quantitative trait nucleotides,QTN)與腿肌重、日增重、體長(zhǎng)和胴體性狀相關(guān)聯(lián)[7-8]，且其SNPs位點(diǎn)影響牛早期體重、6～8月齡體重等生長(zhǎng)性狀[9]。目前，波爾山羊的PLAG1基因序列尚未被克隆，其多態(tài)性與其早期生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以波爾山羊?yàn)閷?duì)象，克隆PLAG1基因序列，鑒定其在不同年齡和出生體重波爾山羊組織中的表達(dá)模式，篩選波爾山羊PLAG1基因SNP位點(diǎn)，并與出生羔羊的生長(zhǎng)指標(biāo)(出生體重、出生體長(zhǎng)、出生體高、出生胸圍和出生管?chē)?進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為山羊的早期分子育種提供候選分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

217只波爾山羊羔羊及其生長(zhǎng)性狀(出生體重、出生體長(zhǎng)、出生胸圍和出生管?chē)劝凑粘Ｒ?guī)方法測(cè)定)相關(guān)資料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地提供。試驗(yàn)羊在相同飼養(yǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)水平下統(tǒng)一管理。采集試驗(yàn)羊耳組織置于凍存管中，用冰桶帶回實(shí)驗(yàn)室，―20 ℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)挑選6只初生羔羊，按照體重大小分為2組：一組出生體重分別為2.6、2.5和2.4 kg，平均出生體重為2.5 kg，為出生體重較高組；另一組出生體重分別為2.3、2.1和1.9 kg，平均出生體重為2.1 kg，為出生體重較低組，兩組羊出生體重差異顯著(P<0.05)。選取1歲母羊和120日齡胎羊各3只，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、腿肌、小腸等組織于凍存管后立即放于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMasterMix、Real-time PCR試劑盒、瓊脂糖(南京諾唯贊生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白抗體PLAG1(#H0000532，Abnova公司)；β-tubulin(#11224-1-AP，Proteintech公司)。

1.3 DNA、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用酚/氯仿法提取波爾山羊耳組織DNA，采用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度與純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊PLAG1基因預(yù)測(cè)序列(GenBank登錄號(hào)：XM_005688991.3)，利用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，用于波爾山羊PLAG1基因CDS、3′-UTR區(qū)序列擴(kuò)增及SNP篩選，并設(shè)計(jì)PLAG1基因定量引物，以β-actin(GenBank登錄號(hào)：NM_001314342)為內(nèi)參基因，鑒定波爾山羊各組織中PLAG1基因表達(dá)量，引物信息見(jiàn)表1。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

以波爾山羊腿肌cDNA為模板，利用P1、P2 2對(duì)引物通過(guò)巢式PCR對(duì)PLAG1基因CDS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，利用引物P5對(duì)PLAG1基因3′-UTR區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系20 μL：2×TaqMasterMix (Dye Plus) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將純化回收的DNA與pMD19-T克隆載體于16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，陽(yáng)性菌液經(jīng)PCR鑒定(用引物P2進(jìn)行菌液PCR鑒定)后送南京擎科生物有限公司測(cè)序。

1.6 序列分析

用DNAMAN 6.0和DNAStar軟件進(jìn)行氨基酸序列翻譯及與其他物種序列比對(duì)，同源序列用NCBI BLAST進(jìn)行搜索，使用NCBI的ORF Finder(http:∥www.ncbi.nih.gov/projects/gorf)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting

以β-actin為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)不同出生體重波爾山羊羔羊、胎羊和成年母羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸和骨骼肌組織中PLAG1基因的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2.0 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。定量結(jié)果采用2―△△Ct法進(jìn)行處理分析。

分別提取不同體重羔羊腿肌總蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。參照李隱俠等[10]方法進(jìn)行Western blotting試驗(yàn)，使用Image J軟件進(jìn)行條帶密度分析。

1.8 PLAG1基因在波爾山羊群體中SNPs鑒定及基因分型

隨機(jī)挑選30個(gè)波爾山羊耳組織DNA樣，每5個(gè)DNA樣混為1個(gè)DNA池。以混池DNA為模板，利用P1、P2和P5引物進(jìn)行PLAG1基因CDS和3′-UTR區(qū)序列擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序同1.5，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Chromas 2.3軟件分析，查找SNPs位點(diǎn)，再對(duì)217只波爾山羊進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和基因分型，統(tǒng)計(jì)不同基因型在波爾山羊群體中的基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)、雜合度(heterozygosity,He)等指標(biāo)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析(One-Way ANOVA)對(duì)PLAG1基因各SNP位點(diǎn)不同基因型與波爾山羊出生體重、出生體長(zhǎng)、出生胸圍和出生管?chē)M(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PLAG1基因CDS和3′-UTR區(qū)序列擴(kuò)增

以波爾山羊腿肌cDNA為模板，以P1和P2為引物，采用巢式PCR方法擴(kuò)增波爾山羊PLAG1基因CDS區(qū)，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一DNA條帶，片段大小約為1 596 bp(圖1A)，與預(yù)期片段大小一致。對(duì)鑒定正確的產(chǎn)物切膠回收后克隆測(cè)序，對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)，獲得山羊PLAG1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列；以P5為引物擴(kuò)增波爾山羊PLAG1基因3′-UTR序列，獲得長(zhǎng)約1 689 bp的片段(圖1B)，與預(yù)期大小一致。兩段序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊PLAG1基因預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_013969222)的相似性均為100%。

2.2 波爾山羊PLAG1序列分析

序列分析發(fā)現(xiàn)，波爾山羊PLAG1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1 500 bp，A、T、G、C含量分別為24.07%、18.60%、25.33%和32.00%，其中GC含量為57.33%，AT含量為42.67%，共編碼499個(gè)氨基酸。DNAMAN軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，波爾山羊PLAG1基因CDS區(qū)序列與人(登錄號(hào)：NM_001114634)、豬(登錄號(hào)：XM_021089354)、牛(登錄號(hào)：XM_005215432)、綿羊(登錄號(hào)：XM_012183720.2)等哺乳動(dòng)物的核苷酸序列相似性分別為85.6%、91.6%、98.6%和99.2%，氨基酸序列相似性分別為96.4%、95.2%、99.8%和99.8%(表2)。山羊與綿羊、牛的氨基酸序列相似性最高，均在第366位氨基酸處有差別，綿羊和牛為纈氨酸，而山羊?yàn)榈鞍彼幔f(shuō)明在哺乳動(dòng)物中PLAG1蛋白非常保守。

表2 波爾山羊與其他哺乳動(dòng)物間PLAG1基因核苷酸和氨基酸序列相似性

2.3 山羊PLAG1基因的組織表達(dá)模式

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PLAG1基因在出生體重較大的羔羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸和腿肌中的表達(dá)水平高于出生體重較小的羔羊組織，其中心臟和腿肌中表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，小腸中表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)(圖2)。出生體重較大的羔羊腿肌中PLAG1蛋白表達(dá)水平極顯著高于羔羊體重較小羔羊(P<0.01，圖3)。PLAG1基因在成年母羊各組織中的表達(dá)水平普遍偏低，均顯著或極顯著低于妊娠末期胎羊各組織(P<0.05；P<0.01，圖4)。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

圖3 PLAG1蛋白在不同出生體重羔羊腿肌中的表達(dá)量

圖4 PLAG1基因在胎羊和成年母羊各組織中的表達(dá)量

2.4 波爾山羊PLAG1基因SNP位點(diǎn)篩選

利用P1、P2和P5引物擴(kuò)增波爾山羊群體PLAG1基因序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)Chromas 2.3軟件分析，在PLAG1基因3′-UTR區(qū)序列中共檢測(cè)到6個(gè)SNPs位點(diǎn)，按照SNPs位點(diǎn)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的山羊PLAG1基因mRNA序列(登錄號(hào)：XM_013969222.2)起始密碼子的距離分別命名為：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G(圖5)。

圖5 波爾山羊PLAG1基因SNPs位點(diǎn)測(cè)序圖

2.5 PLAG1基因SNPs位點(diǎn)基因頻率和基因型頻率

由表3可知，在217只波爾山羊樣本中，6個(gè)SNPs位點(diǎn)均被檢測(cè)到3種基因型，其中，2664 A>G、2712 A>G、2990 A>T、3270 A>G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因均為A，基因頻率分別為68.9%、74.2%、91.5%和77.7%；2721 T>C和2879 T>A位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因均為T(mén)，基因頻率分別為71.4%和68.7%；除2990 A>T位點(diǎn)多態(tài)信息含量為低度多態(tài)外(PIC<0.25)，其余5個(gè)位點(diǎn)均為中度多態(tài)(0.25G位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)外(P<0.05)，其余5個(gè)位點(diǎn)均處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 波爾山羊PLAG1基因SNPs位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率及遺傳多樣性

2.6 PLAG1基因SNPs位點(diǎn)不同基因型與波爾山羊出生體重、體尺的關(guān)聯(lián)分析

由表4可知，在217只波爾山羊樣本中，2664 A>G位點(diǎn)AG基因型個(gè)體出生管?chē)@著大于GG型(P<0.05)；2721 T>C位點(diǎn)TT基因型個(gè)體出生體長(zhǎng)顯著大于TC基因型(P<0.05)，TT基因型個(gè)體出生體重有大于TC基因型個(gè)體的趨勢(shì)，提示T等位基因?qū)w長(zhǎng)和體重的增加更有利；2879 T>A位點(diǎn)TA基因型個(gè)體出生管?chē)@著大于AA基因型(P<0.05)；2990 A>T位點(diǎn)AA基因型個(gè)體出生體重顯著大于AT基因型(P<0.05)，AA基因型個(gè)體在體尺性狀上雖然與AT、TT基因型差異不顯著，但有上升趨勢(shì)；3270 A>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體出生體長(zhǎng)顯著大于AA基因型(P<0.05)，AG基因型個(gè)體出生胸圍顯著大于AA基因型(P<0.05)，GG基因型個(gè)體在體重、體高、管?chē)?個(gè)性狀上均有上升趨勢(shì)，提示G等位基因?qū)Σ柹窖蛏L(zhǎng)有利；其余位點(diǎn)各指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。

表4 PLAG1基因SNPs位點(diǎn)各基因型與波爾山羊出生體重、體尺的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

3.1 PLAG1序列及組織表達(dá)特征

研究表明，序列高度一致的蛋白質(zhì)其結(jié)構(gòu)和功能高度相似[11]。Sousounis等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在分子進(jìn)化過(guò)程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)越保守其功能也越保守。本研究獲得波爾山羊PLAG1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PLAG1蛋白在哺乳動(dòng)物間相似性達(dá)到95.2%以上，與牛和綿羊的相似性均為99.8%，說(shuō)明PLAG1蛋白在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中非常保守。研究發(fā)現(xiàn)，敲除PLAG1基因可導(dǎo)致小鼠胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受阻[4]，PLAG1基因突變影響牛、豬和綿羊的生長(zhǎng)和屠宰性狀[7，13-14]，提示PLAG1基因可能在波爾山羊生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮十分重要的功能。PLAG1基因在胚胎期的表達(dá)量較高，而在大多數(shù)成體器官中的表達(dá)量較低或不表達(dá)[5]。PLAG1基因主要在人胚胎組織中表達(dá)，而在成人組織如心臟、腦、肺臟、肝臟、骨骼肌和胰腺中的表達(dá)量較低[1]。成年小鼠PLAG1基因轉(zhuǎn)錄本在腦、胸腺、胃、腸、脾臟、前列腺、骨骼肌、腎臟、唾液腺、子宮、舌、肺臟和肝臟中的表達(dá)量均低于檢測(cè)限[1]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同出生體重羔羊PLAG1基因在心臟、小腸和腿肌組織中呈差異表達(dá)，提示PLAG1基因可能通過(guò)調(diào)控肌肉發(fā)育影響羔羊體重，而胎羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和腿肌組織中的表達(dá)量均顯著或極顯著高于成年母羊，說(shuō)明山羊組織中PLAG1基因的表達(dá)模式與小鼠和人相似，在胎兒期表達(dá)量較高，出生后隨著年齡增加表達(dá)量逐漸降低。

3.2 PLAG1基因與動(dòng)物生長(zhǎng)的關(guān)系

Hensen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PLAG1基因缺失小鼠體型較?。簭呐咛テ?1.5 d開(kāi)始，PLAG1基因缺失小鼠胚胎比同窩對(duì)照組胚胎小約18%；出生時(shí)，PLAG1基因缺失小鼠幼仔僅占同窩野生型小鼠體重的70%；出生后21 d，PLAG1基因缺失小鼠體重比同窩對(duì)照組小約50%，說(shuō)明PLAG1基因敲除使小鼠胚胎期和出生后生長(zhǎng)受阻。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLAG1基因表達(dá)水平與波爾山羊出生體重呈顯著關(guān)聯(lián)，出生體重較大的羔羊心臟、肝臟、脾臟、睪丸、小腸、腿肌組織中PLAG1基因表達(dá)量均大于出生體重較小的羔羊，其中心臟和腿肌中表達(dá)量差異顯著，小腸中表達(dá)量差異極顯著；出生體重較大的羔羊腿肌中PLAG1基因表達(dá)量極顯著高于出生體重較小的羔羊，這與Hensen等[4]研究結(jié)果相似，提示PLAG1基因表達(dá)與羔羊體重相關(guān)，為進(jìn)一步研究PLAG1基因?qū)ι窖蛏L(zhǎng)性狀的影響提供了依據(jù)。

大量研究表明，PLAG1基因在動(dòng)物的生長(zhǎng)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，在豬、牛、馬、綿羊中均已發(fā)現(xiàn)與體尺、體重性狀相關(guān)的SNPs[6,8,15-17]；PLAG1基因是影響豬平均背脂厚、肢骨長(zhǎng)的候選基因[18-19]，與豬的脊椎數(shù)呈顯著相關(guān)，從而影響豬的體長(zhǎng)性狀[20]。Utsunomiya等[13]研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代牛體長(zhǎng)的恢復(fù)主要受到PLAG1基因單倍型(Q)選擇的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，2721 T>C位點(diǎn)TT基因型個(gè)體出生體長(zhǎng)顯著大于TC基因型，3270 A>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體出生體長(zhǎng)顯著大于AA基因型，提示2721 T>C位點(diǎn)TT基因型和3270 A>G位點(diǎn)GG基因型可以用于波爾山羊選育，其影響體長(zhǎng)的原因有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，PLAG1-NCAPG基因間隔區(qū)1個(gè)QTN與日本和牛閹牛日增重、體長(zhǎng)、胴體性狀相關(guān)[8]；PLAG1基因SNPs可影響牛早期體重及6～8月齡體重[9]；PLAG1基因中1個(gè)15 bp插入顯著上調(diào)了山羊的體重和胸圍[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，2990 A>T位點(diǎn)AA基因型個(gè)體出生體重顯著高于AT基因型，AA基因型個(gè)體體尺相關(guān)性狀均有增加的趨勢(shì)，提示2990 A>T位點(diǎn)AA基因型有利于增加波爾山羊體重。綜上所述，PLAG1基因分子標(biāo)記可用于山羊體尺和體重的選育。

4 結(jié) 論

本研究克隆獲得波爾山羊PLAG1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1 500 bp序列。PLAG1基因在胎羊各組織中表達(dá)水平極顯著高于成年羊，PLAG1基因表達(dá)量高、低與羔羊出生體重呈顯著關(guān)聯(lián)。在波爾山羊群體中共篩選到6個(gè)PLAG1基因SNPs位點(diǎn)，其中2721 T>C位點(diǎn)TT基因型、2990 A>T位點(diǎn)AA基因型、3270 A>G位點(diǎn)GG基因型均為有利基因型，可顯著增加波爾山羊的出生體重及體尺，表明PLAG1基因可作為候選基因用于波爾山羊早期生長(zhǎng)選擇。