高嘉豪，喬彥杰，連科迅，王蒙蒙，谷新利，邵永斌

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003)

在畜禽生產(chǎn)中，免疫應(yīng)激常導(dǎo)致畜禽機(jī)體某些組織器官的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生病理性變化，造成生長(zhǎng)性能和產(chǎn)品品質(zhì)下降，死亡率升高[1]。陳理盾等[2]研究表明，實(shí)際生產(chǎn)中單是疫苗注射引起的免疫應(yīng)激就能顯著影響雛雞體重，最高時(shí)達(dá)20%，最低時(shí)也有2%。因此在臨床生產(chǎn)中，獸醫(yī)針對(duì)畜禽應(yīng)激，常用到一些抗生素進(jìn)行處理，但容易使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，并產(chǎn)生藥物殘留等諸多弊端，而中草藥添加劑具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育﹑調(diào)節(jié)免疫力等作用[3-4]，因此研制安全有效、天然無抗的中草藥添加劑代替抗生素已成為畜牧行業(yè)減抗乃至無抗養(yǎng)殖的解決途徑之一[5]。

甘草屬于豆科植物甘草屬，是中醫(yī)藥及中獸醫(yī)中廣泛應(yīng)用且具有悠久歷史的中草藥，用藥部位主要是根莖部，具有極為豐富的生物學(xué)作用。甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是從甘草中分離出的三萜皂苷類活性物質(zhì)，是甘草提取物中含量最多的化合物，同時(shí)也是甘草質(zhì)量評(píng)定的最主要指標(biāo)之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理特性[6-7]。陳璟怡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加0.1%甘草提取物可對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，同時(shí)可提高其免疫器官指數(shù)與疫苗免疫后的抗體效價(jià)。邵琦等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飲水中添加50 mg/L甘草霜(粉狀甘草粗提物)可增強(qiáng)肉仔雞免疫作用和抗氧化功能。但是GA作為抗生素替代品用于改善黃羽肉仔雞免疫性能的研究較少。

本研究使用GA作為飼料添加劑，通過建立黃羽肉仔雞脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)免疫應(yīng)激模型并測(cè)定血清免疫指標(biāo)，評(píng)價(jià)GA免疫調(diào)節(jié)作用，以期為GA在黃羽肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用或深入研究提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

GA(98%)和黃芪多糖(70%)，均購(gòu)自上海吉至生化科技有限責(zé)任公司；LPS(EscherichiacoliO55:B5)購(gòu)自Sigma公司；雞免疫球蛋白A(IgA) ELISA試劑盒(批號(hào)：202107)、雞免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒(批號(hào)：202107)、雞免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒(批號(hào)：202107)、雞CD4分子ELISA試劑盒(批號(hào)：202107)和雞CD8分子ELISA試劑盒(批號(hào)：202107)均購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sartorius BS210S電子分析天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ST16 ST16R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；多功能酶標(biāo)儀Biotek SynergeyTM2購(gòu)自伯騰儀器有限公司；WP25AB恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海滬粵明科學(xué)儀器公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧標(biāo)準(zhǔn)

300只1日齡體重相近的健康快大型黃羽肉仔雞購(gòu)自新疆泰昆集團(tuán)股份有限公司石河子市某孵化廠；基礎(chǔ)飼糧為全價(jià)配合飼料(烏魯木齊正大畜牧有限公司)，基礎(chǔ)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平見表1。肉仔雞適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、LPS組、黃芪多糖組(APS)、高劑量GA組(GAH)、中劑量GA組(GAM)和低劑量GA組(GAL)?？瞻讓?duì)照組于14、16、18和20日齡10：00～11：00腹腔注射0.9%無菌生理鹽水2 mL，其余組注射等體積LPS溶液(1.5 mg/kg BW)建立體內(nèi)免疫應(yīng)激模型?？瞻讓?duì)照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧，APS組、GAH組、GAM組和GAL組于應(yīng)激模型建立階段及前后3天(即11～23 d)分別在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg APS和120、100、80 mg/kg GA。試驗(yàn)期49 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表

1.3 飼養(yǎng)管理

肉仔雞采用室內(nèi)網(wǎng)上平養(yǎng)方式，雞舍用具于入雞前3周徹底打掃沖洗，采用固體甲醛熏蒸消毒1周，通風(fēng)。入雞前24 h內(nèi)使用控制器將雞舍溫度保持在32～35 ℃，入雞后溫度不變且24 h光照維持1周，之后溫度每周下降2～3 ℃，最后控制在20～22 ℃，每天光照23 h。所有試驗(yàn)雞用常規(guī)免疫程序免疫，自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理方式均一致。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)雞第21、28、35、42、49日齡，每組隨機(jī)選取10只雞，每個(gè)重復(fù)2只，翅靜脈采血5 mL/只，采集的血液在常溫下傾斜靜置2 h，再3 000 r/min離心10 min，收集血清，—20 ℃保存?zhèn)溆?。最后按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定免疫細(xì)胞CD4、CD8和免疫活性物質(zhì)IgA、IgG、IgM含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，對(duì)差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 GA對(duì)肉仔雞血清CD4分子含量的影響

由表2可知，21～49日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，其余5組肉仔雞血清CD4分子含量均極顯著下降(P<0.01)，尤其是LPS組，下降幅度最大。與LPS組相比，APS組和3個(gè)GA組肉仔雞血清CD4分子含量均有所升高，其中GAH組的升高幅度與APS組最接近，且均極顯著或顯著高于LPS組(P<0.01；P<0.05)；在3個(gè)GA組間，肉仔雞血清CD4分子含量均隨GA添加量增加而升高，尤其是在42日齡時(shí)，GAH組與APS組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 肉仔雞血清CD4分子含量檢測(cè)結(jié)果

2.2 GA對(duì)肉仔雞血清CD8分子含量的影響

由表3可知，21～49日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，其余5組肉仔雞血清CD8分子含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個(gè)GA組肉仔雞血清CD8分子含量均極顯著或顯著降低(P<0.01；P<0.05)，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，且兩組間無顯著差異(P>0.05)；在35和49日齡時(shí)，GAH組肉仔雞CD8分子含量與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表3 肉仔雞血清CD8分子含量的檢測(cè)結(jié)果

2.3 GA對(duì)肉仔雞血清IgA含量的影響

由表4可知，21～49日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，其余5組肉仔雞血清IgA含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個(gè)GA組肉仔雞血清IgA含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個(gè)GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgA含量呈降低趨勢(shì)，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除35日齡外，其他日齡時(shí)兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在21和49日齡時(shí)，GAH組與空白對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。

表4 肉仔雞血清IgA含量的檢測(cè)結(jié)果

2.4 GA對(duì)肉仔雞血清IgG含量的影響

由表5可知，21～49日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，其余5組肉仔雞血清IgG含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個(gè)GA組肉仔雞血清IgG含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個(gè)GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgG含量呈降低趨勢(shì)，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除28日齡外，其他日齡時(shí)兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在35日齡時(shí)，GAH組與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表5 肉仔雞血清IgG含量的檢測(cè)結(jié)果

2.5 GA對(duì)肉仔雞血清IgM含量的影響

由表6可知，21～49日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，LPS組、GAL組和GAM組肉仔雞血清IgM含量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個(gè)GA組肉仔雞血清IgM含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個(gè)GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgM含量呈降低趨勢(shì)，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除42日齡外，其他日齡時(shí)兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在21日齡時(shí)，GAH組與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表6 肉仔雞血清IgM含量的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

CD4分子主要由輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1、Th2)表達(dá)，在MHCⅡ分子進(jìn)行抗原遞呈時(shí)，可參與T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別、信號(hào)傳遞等,同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞活化，因此CD4分子與細(xì)胞免疫關(guān)聯(lián)密切[10]。CD8分子主要由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表達(dá),通過MHCⅠ等多種途徑對(duì)識(shí)別抗原、裂解靶細(xì)胞具有重要作用[11]。LPS是目前較為常用的免疫應(yīng)激模型的造模劑[12-13],尤其在建立肉仔雞的免疫應(yīng)激模型時(shí)，效果較好[14-15]，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體中樞和外周細(xì)胞因子的升高和多種炎性細(xì)胞因子的分泌。Wang等[7]試驗(yàn)結(jié)果表明，GA能夠通過核因子κB(NF-κB)和JNK信號(hào)通路激活雞的巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，提高細(xì)胞免疫因子等的表達(dá)水平。王元元等[16]研究表明，GA可對(duì)小鼠的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，GA與腎上腺皮質(zhì)激素的結(jié)構(gòu)相似，功能相近，對(duì)于糖皮質(zhì)激素受體(GR)同時(shí)具有激動(dòng)和頡頏作用[17]。楊思雨[18]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方甘草酸苷治療兒童肺炎后，CD4+、CD8+細(xì)胞水平降低、CD4+/CD8+細(xì)胞水平升高并接近正常。洪安林[19]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線光療聯(lián)合復(fù)方甘草酸銨加消銀顆粒治療銀屑病時(shí)CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群水平高于對(duì)照組。郭凡溪[20]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方甘草酸單胺粉可緩解因LPS聯(lián)合恩諾沙星的炎癥模型中雞外周血T細(xì)胞亞群紊亂。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的黃羽肉仔雞體內(nèi)免疫應(yīng)激模型效果良好，對(duì)血清CD4分子含量降低和CD8分子含量的升高作用極顯著；而GA各組對(duì)緩解以上現(xiàn)象均有較好效果，說明GA同其相關(guān)物如甘草酸苷、甘草酸單胺、復(fù)方甘草酸銨等在T淋巴細(xì)胞參與的免疫方面具有相似作用；與具有增強(qiáng)免疫作用的APS組相比較，GAH組CD8和CD4分子含量與APS組接近，可見其免疫調(diào)節(jié)作用較好，且存在劑量效應(yīng)。此外，CD4分子含量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化方面表現(xiàn)為各組總體上均在28與42日齡呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能是28日齡時(shí)藥效的作用還未達(dá)到峰值，而42日齡時(shí)藥效的作用已經(jīng)不明顯；CD8分子含量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化方面表現(xiàn)為各組總體上均在35日齡呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能此時(shí)應(yīng)激損傷的強(qiáng)度最大，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

免疫球蛋白廣泛分布在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境和分泌物中，結(jié)構(gòu)與抗體相似，具有免疫活性。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激肉仔雞后其血清IgG含量明顯升高。李國(guó)軍[22]研究發(fā)現(xiàn)，LPS造成的免疫應(yīng)激可顯著升高黃羽肉雞的血清IgG和IgM含量。李昆[23]研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞注射LPS后引起了肉仔雞的免疫系統(tǒng)過度活化，從而使體液免疫中血清IgA和IgG的含量明顯升高。丁艷[24]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)京紅1號(hào)蛋雛雞腹腔注射LPS后其血清中IgG、IgA以及CD4的含量顯著提高。毛予龍[25]研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸苷可顯著上調(diào)小鼠回腸中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)以及血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-10、IL-12與γ干擾素(IFN-γ)的含量，增強(qiáng)免疫功能。朱萬剛等[26]研究發(fā)現(xiàn)，甘草浸膏粉能顯著提高豬瘟疫苗免疫后斷乳仔豬的豬瘟病毒抗體(CSFV-Ab)、IgM、IgA、IgG含量，同時(shí)可以降低料重比，提高仔豬免疫力，增加斷奶后仔豬外周血中的紅細(xì)胞數(shù)量。司常云[27]研究發(fā)現(xiàn)，α體GA制劑在治療自身免疫性肝炎的過程中，患者高于正常指標(biāo)的IgG、C反應(yīng)蛋白、γ-球蛋白等顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的黃羽肉仔雞體內(nèi)免疫應(yīng)激模型在血清IgA、IgG、IgM升高方面效果良好，與李昆[23]和丁艷[24]的研究結(jié)果一致，而GA各組對(duì)緩解以上現(xiàn)象均有較好效果，說明GA同甘草酸苷、甘草浸膏粉及部分GA制劑具有相似作用。與公認(rèn)具有增強(qiáng)免疫作用的APS組相比，3個(gè)濃度的GA在緩解LPS刺激引起的黃羽肉仔雞血清IgA、IgG、IgM升高方面均具有極顯著的效果，其中GAH組IgA、IgG和IgM含量與APS組接近，可見其免疫調(diào)節(jié)效果好。但GA在肉仔雞中應(yīng)用的最佳劑量和作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，GA具有較好的免疫增強(qiáng)效果，其具有多種藥理作用，與傳統(tǒng)免疫增強(qiáng)藥物APS的效果相近時(shí)劑量卻遠(yuǎn)低于APS，可見其具有較大研究意義，本課題組率先研究了GA對(duì)黃羽肉仔雞的免疫作用，豐富了GA作為畜禽添加劑應(yīng)用的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明，肉仔雞飼糧中添加80、100和120 mg/kg BW GA時(shí)可緩解LPS造成的免疫系統(tǒng)過度活化引起的血清IgA、IgG、IgM異常升高現(xiàn)象，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且其免疫調(diào)節(jié)能力有劑量效應(yīng)。