汪曼麗，譚子涵，王帥杰，李 倩，曾一桐，王 蕾,2，趙 迪,2，張 倩，2，侯永清,2

(1.武漢輕工大學，動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，武漢 430023；2.武漢輕工大學，動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性腸道傳染病[1]。仔豬感染后會出現(xiàn)急性腹瀉、脫水、生長性能下降等狀況[2]。目前，疫苗接種是預防PEDV的主要措施，但在近幾年中，PEDV不斷變異，在不同毒株之間經(jīng)常發(fā)生重組，甚至PEDV和其他冠狀病毒之間也會發(fā)生重組，所以疫苗接種不能有效控制PEDV感染，這使得豬場控制PED變得非常困難，也給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

黃酮類化合物是治療多種疾病的重要輔助劑，因其廣泛的生物活性引起了動物營養(yǎng)研究者們的關(guān)注[4]。槲皮素是一種多酚類化合物。研究表明，槲皮素具有多種生物活性作用，例如抗氧化、抗病毒、抗癌和抗炎等[5]。Li等[6]通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對PEDV表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病毒活性；孫蕾[7]研究表明，槲皮素可有效改善脂多糖(LPS)刺激導致的肉雞腸道損傷。當前，關(guān)于槲皮素對PEDV感染仔豬的影響報道較少，因此，本試驗構(gòu)建PEDV感染幼齡仔豬模型，研究槲皮素對PEDV感染仔豬生長性能、血液生化指標和腸道吸收與屏障功能的影響，為其在防治仔豬感染PEDV中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PEDV YN毒株(GenBank登錄號：KT021228)在Vero細胞上增殖培養(yǎng)，并保存于-80 ℃；槲皮素購自MCE公司，純度為98.02%；試驗飼糧為奶粉(商品名：紐瑞茲全脂奶粉)，其營養(yǎng)成分見表1；D-木糖測定試劑盒和二胺氧化酶(DAO)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus試劑、PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseHPlus)均購自寶生物工程(大連)有限公司；全自動生化分析儀(HITACHI 7020)購自上海曼普生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)購自賽默飛世爾科技公司。

表1 奶粉營養(yǎng)成分

1.2 試驗動物與分組

本試驗選用18頭平均體重為(2.6±0.3)kg的7日齡健康斷奶仔豬(杜洛克×長白×大白)，隨機分為3個處理組：對照組、PEDV組和PEDV+槲皮素組。每個處理6個重復，每個重復1頭豬。試驗期11 d，第0～3天為適應期，均飼喂人工乳(用45～55 ℃溫水沖泡奶粉，奶粉與水的比例為1∶4)。試驗第4～10天，PEDV+槲皮素組仔豬口腔灌服10 mg/kg BW槲皮素(以人工乳配成懸濁液)，其他組仔豬口腔灌服等體積的人工乳。試驗第8天PEDV組與PEDV+槲皮素組仔豬口腔灌服1×104.5TCID50PEDV，對照組灌服等體積的PBS溶液。

1.3 飼養(yǎng)管理

在進行試驗前將豬舍和豬欄徹底清洗并消毒，豬舍為密閉式，試驗期間通風狀況良好。豬舍分為2個，將對照組仔豬飼養(yǎng)在一間豬舍，PEDV與PEDV+槲皮素組飼養(yǎng)在另一間豬舍。兩豬舍的大小、建筑設(shè)計及室溫條件(舍溫保持在22～25 ℃)完全一致。試驗期間每天打掃豬舍，早、晚各1次，并用聚維酮碘消毒液消毒，嚴格防止兩豬舍之間發(fā)生交叉感染。仔豬每天飼喂5次(時間為7：30、11:00、15:00、18：00、21:00)，早晚各喂1次溫水。

1.4 樣品采集與處理

于試驗第11天早上，對仔豬進行空腹稱重，前腔靜脈采血保存于10 mL肝素鈉抗凝管中，血樣靜置15 min后，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，分裝，于-80 ℃保存待測。屠宰后取空腸中間段(長度10 cm)，縱向剖開腸段，用預冷的無RNA酶水沖洗內(nèi)容物，刮取并收集腸黏膜，置于液氮中快速冷凍后于-80 ℃保存待測。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生長性能 于試驗第4、8和11天早晨給隔夜禁食的仔豬稱重，計算仔豬的平均日增重。試驗期間采用視覺評分法每天7：00和20：30觀察仔豬的糞便形態(tài)，進行評分，然后再計算日平均值。糞便評分標準為：糞便正常、干燥成型記為0分；糞便呈糊狀記為1分；糞便呈半液體狀記為2分；糞便呈液體狀記為3分。

1.5.2 血液生化指標 采用全自動生化分析儀測定血漿中總膽紅素(TBLL)、總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肌酐(CREA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、尿素氮(BUN)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和磷酸肌酸激酶(CK)含量。

1.5.3 血漿D-木糖含量和DAO活性 血漿D-木糖含量和DAO活性按照試劑盒說明書的操作步驟測定。

1.5.4 空腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測腸道屏障功能相關(guān)基因：腸絨毛蛋白(villin)、緊密連接蛋白-1(claudin-1)、閉合蛋白(occludin)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)的相對表達量，以核糖體蛋白L4(RPL4)為內(nèi)參基因。各基因引物信息見表2。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。將空腸黏膜樣品于液氮中研磨，用RNAiso Plus試劑提取總RNA，并使用NanoDrop 2000測定RNA的濃度和純度。根據(jù)PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseHPlus)試劑盒方法配制實時熒光定量PCR反應體系，反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。參照Hou等[8]方法,以2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表2 引物信息

續(xù)表

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對PEDV感染仔豬平均日增重和糞便形態(tài)評分的影響

由表3可知，與對照組相比，PEDV感染顯著降低了仔豬的平均日增重(P<0.05)，顯著提高了仔豬糞便形態(tài)評分(P<0.05)；與PEDV組相比，灌服槲皮素顯著提高了仔豬的平均日增重(P<0.05)，且有降低糞便形態(tài)評分的趨勢(P>0.05)。

表3 各組仔豬平均日增重和糞便形態(tài)評分

2.2 槲皮素對PEDV感染仔豬血液生化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，PEDV組血液中肌酐和尿素氮的含量顯著升高(P<0.05)，高密度脂蛋白的含量顯著降低(P<0.05)；與PEDV組相比，PEDV+槲皮素組血液中肌酐和尿素氮的含量顯著降低(P<0.05)。其他指標在3組間均無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組仔豬血液生化指標測定結(jié)果

續(xù)表

2.3 槲皮素對PEDV感染仔豬血漿DAO活力和D-木糖含量的影響

由表5可知，與對照組相比，PEDV組顯著降低了血漿中D-木糖含量(P<0.05)；與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組顯著升高了血漿D-木糖含量(P<0.05)。DAO活性在3組間差異均不顯著(P>0.05)。

表5 各組仔豬血漿DAO活力和D-木糖含量

2.4 槲皮素對PEDV感染仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因相對表達量的影響

由表6可知，與對照組相比，PEDV感染下調(diào)了仔豬空腸claudin-1、iFABP基因的相對表達量(P<0.05)；與PEDV組相比，灌服槲皮素顯著上調(diào)了仔豬空腸villin、claudin-1和iFABP基因的相對表達量(P<0.05)。

表6 各組仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因的相對表達量

3 討 論

3.1 槲皮素對PEDV感染仔豬平均日增重的影響

PEDV是具有高度傳染性的急性腸道傳染病病原，PEDV感染會引起仔豬生長緩慢、生產(chǎn)機能下降以及腸道功能紊亂等狀況[9]。槲皮素是植物中分布最廣的黃酮類化合物之一，并且黃酮類物質(zhì)能夠提高機體的抗病能力,促進畜禽的生長。肖風林[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量的槲皮素，對肉雞平均日采食量和平均日增重均沒有顯著影響。王密[11]研究表明，飼喂不同水平的槲皮素對AA肉雞的生長性能均無顯著影響。同樣，本研究表明在試驗第4～8天，槲皮素對仔豬生長性能未產(chǎn)生顯著影響，但可緩解因PEDV感染而導致的生長抑制。糞便形態(tài)評分是根據(jù)動物糞便成型狀態(tài)進行判斷，可反應動物的腹瀉情況。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補充槲皮素可降低斷奶仔豬糞便評分。在本研究中，PEDV感染后，仔豬的糞便形態(tài)評分顯著提高，添加槲皮素后糞便形態(tài)評分有降低的趨勢，說明槲皮素對仔豬腹瀉有一定的緩解作用，這可能與槲皮素具有抗病毒和增強機體免疫功能的作用有關(guān)[6，13]。

3.2 槲皮素對PEDV感染仔豬血液生化指標的影響

高密度脂蛋白是由數(shù)百種不同脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的脂蛋白顆粒的異質(zhì)混合物，有1/3的已鑒定蛋白質(zhì)在脂質(zhì)代謝中起作用，其余蛋白質(zhì)在蛋白酶抑制、補體調(diào)節(jié)、止血和炎癥中發(fā)揮作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染后血液中高密度脂蛋白含量降低，說明PEDV感染導致仔豬產(chǎn)生應激。血液生化指標的差異與機體新陳代謝、營養(yǎng)狀況的改變和疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而血液尿素氮和肌酐是反應腎功能的重要標志物[15]，同時在一定程度上可間接反映動物機體對蛋白質(zhì)的利用效率。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，血清尿素氮含量上升可減少蛋白質(zhì)合成沉積，降低氮的利用率，表明其含量高低與蛋白質(zhì)利用效率和生長性能呈負相關(guān)，當機體腎功能損傷時，血液尿素氮和肌酐的水平會相應增加[17]。卓秀萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染會導致哺乳仔豬腎表面出現(xiàn)細小出血點以及蛋白管型，表明PEDV感染會導致仔豬腎臟損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著降低斷奶仔豬血清尿素氮的含量[19]，在LPS誘導的小鼠腎損傷模型中，槲皮素可降低血液肌酐和尿素氮的水平[20]。另有研究表明，通過血液進入腎臟的槲皮素代謝物因腎臟代謝而發(fā)生轉(zhuǎn)化反應，可對腎臟起保護作用[21]。本試驗中，槲皮素可緩解PEDV感染導致的仔豬血液尿素氮和肌酐含量的增加，這一結(jié)果表明仔豬在攝取槲皮素后可通過提高機體氨基酸利用率和改善蛋白質(zhì)代謝，緩解因PEDV感染導致的腎功能損傷。

3.3 槲皮素對PEDV感染仔豬血漿DAO活性和D-木糖含量的影響

DAO是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，其活性可以作為腸黏膜完整性以及黏膜損傷和恢復的重要標志物，腸道黏膜細胞受損壞死后，DAO會釋放至血液中，導致血漿中DAO活性增加[22]。本試驗中，PEDV感染未顯著提高血漿DAO活性，這可能與PEDV的毒力有關(guān)。血漿D-木糖濃度是腸道吸收能力的特異性和敏感指標。在健康豬中，D-木糖很容易被小腸吸收。然而，在吸收不良、腸道發(fā)生損傷時，D-木糖從腸腔到門靜脈的通路受損，經(jīng)腸道吸收后不會被機體代謝，并最終被腎臟排出，從而降低了血液和尿素中的D-木糖濃度[22]。本試驗結(jié)果顯示，槲皮素可以緩解PEDV感染導致的血漿D-木糖含量降低。目前關(guān)于槲皮素治療PEDV感染仔豬的報道較少，但有研究表明，飼糧中添加槲皮素可增加空腸絨毛高度[23]，而腸絨毛高度的增加有助于改善小腸的吸收功能[24]，因此推測槲皮素可能通過改善腸道結(jié)構(gòu)來增強小腸吸收營養(yǎng)的能力。

3.4 槲皮素對PEDV感染仔豬空腸屏障功能相關(guān)基因相對表達量的影響

腸道屏障在維持腸道和整個身體的免疫穩(wěn)態(tài)方面起著極其重要的作用。緊密連接(TJ)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道損傷和炎癥密切相關(guān)。occludin和claudin-1是緊密連接的組成成分，對于維持腸道通透性和腸道屏障功能至關(guān)重要[25]。Luo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)情況下，病原體感染宿主細胞可減少細胞緊密連接蛋白的表達，如claudin-1和occludin。Suzuki等[27]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進Caco-2細胞TJ蛋白、occludin和claudin-1的組裝來增強腸道屏障功能。本試驗結(jié)果表明，PEDV感染下調(diào)了仔豬空腸claudin-1基因的相對表達量，添加槲皮素后，上調(diào)了仔豬空腸claudin-1和occludin基因的相對表達量，這與上述結(jié)果基本一致，說明槲皮素可改善仔豬腸道物理屏障，促進機體健康。

villin是一種組織特異性肌動蛋白結(jié)合蛋白，在腸細胞和近端腎細胞的刷狀緣中表達[28]。在小腸上皮細胞的發(fā)育過程中，villin可決定腸細胞分化程度，并維持其分化狀態(tài)。iFABP是一種細胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在長鏈脂肪酸的運輸中發(fā)揮作用，被認為是腸損傷和腸道屏障功能衰竭的可靠生物標志物[29]。本研究中，PEDV感染顯著下調(diào)了iFABP基因的相對表達量，這與李鵬等[9]研究結(jié)果一致。有研究指出槲皮素的吸收主要發(fā)生在小腸[30],本試驗中，添加槲皮素后，感染仔豬空腸villin和iFABP基因的相對表達量升高，表明槲皮素可減輕腸道損傷，改善腸道功能，這可能是由于腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)后促進了腸黏膜上皮細胞的生長，進而緩解PEDV對腸黏膜的損傷。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，仔豬飼糧中添加10 mg/kg BW的槲皮素可緩解因PEDV感染導致的平均日增重下降和腎功能損傷，可以增強機體腸道的吸收和屏障功能。