魏 佳，柏 琴，羅曉林，官久強，安添午，趙洪文，譚 武，李華德，謝榮清，沙 泉，江明鋒，張翔飛

(1.西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部和四川省重點實驗室，成都 610041；2.四川省草原科學研究院，成都 611731；3.阿壩州紅原縣刷經(jīng)寺鎮(zhèn)人民政府壤口便民服務站，阿壩 624400)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及其周邊地區(qū)特有的家畜，為當?shù)啬撩裉峁┲匾纳a(chǎn)、生活資料，同時其肉、奶等畜產(chǎn)品也是當?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟發(fā)展、牧民增收的重要來源。然而，由于青藏高原特殊的自然環(huán)境和地理位置，牦牛養(yǎng)殖的科學技術發(fā)展相對其他家畜較為滯后，仍多處于“靠天養(yǎng)畜”的傳統(tǒng)純放牧模式。隨母放牧哺乳，至1歲左右自然斷奶是目前犢牦牛的主要培育方式，此培育模式下，犢牦牛因放牧環(huán)境粗放、缺乏早期飼養(yǎng)管理、人畜爭奶、營養(yǎng)不足、自然災害等原因，導致發(fā)病率、死亡率高，生長發(fā)育緩慢，成為當前牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的瓶頸問題。

近年來，國內(nèi)外先后開展了犢牦牛早期斷奶模式的嘗試。武甫德等[1]于2005年首次報道了對犢牦牛進行10 d的短期斷奶有利于提高母牦牛發(fā)情率；朱彥賓等[2]研究發(fā)現(xiàn)，5月齡早期斷奶與傳統(tǒng)隨母放牧相比，犢牦牛生長未受到顯著影響，同時，早期斷奶有利于母牛產(chǎn)后繁殖能力的恢復。作者所在研究團隊對于犢牦牛早期斷奶也進行了探索：通過對犢牦牛進行早期誘飼訓練實現(xiàn)了3月齡提前斷奶，獲國家發(fā)明專利授權(201510364108.3)；并在此基礎上進一步將犢牦牛早期斷奶時間進一步提前至7日齡，但試驗結果顯示，至60日齡時，7日齡斷奶犢牦牛體重顯著低于對照組[3]。因此，犢牦牛早期斷奶培育模式需要更深入的研究和優(yōu)化。益生菌是一類能夠在宿主胃腸道內(nèi)存活繁殖并發(fā)揮益生作用的活性非致病微生物，El-Tawab等[4]認為，微生態(tài)制劑可促進幼齡反芻動物提前斷奶，改善胃腸道微生態(tài)菌群平衡。董曉麗[5]在早期斷奶的荷斯坦犢牛的代乳品中添加植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌，犢牛生長性能得到顯著提高。Kawas等[6]在羔羊補飼酵母菌的研究中也得到類似的結果。但給早期斷奶犢牦牛補充益生菌的培育模式仍鮮有報道，犢牦牛對不同斷奶模式的機體響應機制有待進一步研究。本試驗通過比較隨母放牧哺乳、早期斷奶、早期斷奶搭配益生菌3種斷奶模式對犢牦牛生長發(fā)育、血清生化指標、激素分泌、免疫功能、抗氧化能力的影響，探索適宜的犢牦牛早期斷奶模式，為高寒牧區(qū)犢牦牛早期培育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與飼養(yǎng)管理

于四川省草原科學研究院牦?？萍紙@區(qū)(位于阿壩州紅原縣，海拔3 500 m)選取24頭體重相近、健康的新生犢牦牛，隨機分入3個處理組，每個處理組8頭犢牦牛，公母各半。對照組(GF)犢牦牛出生后在圍欄牧場內(nèi)隨母放牧哺乳，不飼喂代乳粉或開食料，自然斷奶。早期斷奶組(EW)犢牦牛隨母放牧哺乳至15日齡后隔離母犢圈養(yǎng)，開始飼喂代乳粉，以牦牛乳替代部分代乳粉作為過渡，逐漸減少牦牛乳的比例，過渡期7 d。代乳粉以溫水溶解(1∶5)，早晚飼喂兩次。當犢牦牛代乳粉采食量達0.5 kg/d時，開始為其提供開食料及天然牧草，自由采食，至犢牦牛開食料采食量連續(xù)3 d達到0.5 kg/d時停喂代乳粉[7]。90日齡時犢牦牛停喂開食料，轉入天然放牧草場進行放牧飼養(yǎng)。代乳粉、開食料分別購自荷蘭紐維德公司、綿陽鐵騎力士飼料有限公司，代乳粉主要成分：乳清蛋白、椰子油、有機酸、乳化劑、礦物元素、維生素等；開食料主要成分：玉米、麥麩、豆粕、棉粕、植物油、礦物元素、維生素等，營養(yǎng)水平見表1。早期斷奶+益生菌組(EWP)犢牦牛斷奶過程同早期斷奶組，并在代乳粉、開食料分別中添加0.1%、0.2%復合益生菌(乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌，總活菌數(shù)≥9.98×1011CFU/g，購自河北世翔生物技術有限公司)，復合益生菌的添加劑量經(jīng)瘤胃體外發(fā)酵試驗確定(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

表1 代乳粉、開食料的營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1.2 樣品采集及指標測定

1.2.1 生長性能 分別于犢牦牛30、60、90、150日齡時，對各處理組犢牦牛于晨飼前稱重，并測定體尺指標：體高、體斜長、胸圍、管圍[8-9]。

1.2.2 血清生化指標 于犢牦牛30、60、90日齡時，采集各處理組犢牦牛晨飼前頸靜脈血，室溫靜置1 h后3 000 r/min離心15 min分離血清，于-20 ℃凍存。利用全自動生化分析儀(Chemray 800，深圳雷杜生命科技有限公司)測定犢牦牛血清葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)水平；血清β-羥基丁酸(BHBA)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.3 血清激素水平 血清中皮質(zhì)醇(COR)、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)水平采用ELISA法測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.4 免疫功能及抗氧化指標 以ELISA法測定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。分別以酶促反應法測定血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量，比色法測定丙二醛(MDA)含量，鉬酸銨法測定過氧化氫酶(CAT)酶活，生化法測定超氧化物歧化酶(SOD)酶活，MDA檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，其他試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SAS 9.4軟件一般線性模型(GLM)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Student-Newman-Keuls(SNK)模型進行組間多重比較，結果變異程度以標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同斷奶模式對犢牦牛生長發(fā)育的影響

由表2可知，30日齡時，EW、EWP組犢牦牛體重、體高、體斜長、胸圍、管圍均顯著低于GF組(P<0.05)，EW與EWP組間無顯著差異(P>0.05)。60～150日齡犢牦牛體重及體尺指標在各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組犢牦牛生長發(fā)育測定結果

2.2 不同斷奶模式對犢牦牛血清生化指標的影響

由表3可知，30日齡時，犢牦牛血清GLU、TG、CHO濃度以EW、EWP組顯著低于GF組(P<0.05)；同時EW組犢牦牛血清BUN、TP水平均顯著低于GF組(P<0.05)。60日齡時，各組犢牦牛血清生化指標無顯著差異(P>0.05)。90日齡時，EW、EWP組犢牦牛血清GLU、BUN與GF組相比顯著增加(P<0.05)，EWP組TG濃度顯著高于GF組(P<0.05)，其余指標在各組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 各組犢牦牛血清生化指標測定結果

2.3 不同斷奶模式對犢牦牛血清激素水平的影響

由表4可知，30日齡時，EW組犢牦牛血清COR水平顯著高于GF組(P<0.05)，該指標在EWP與GF組間差異不顯著(P>0.05)；60和90日齡時各組犢牦牛血清COR水平無顯著差異(P>0.05)。30日齡時，犢牦牛血清中GH、IGF-1水平以EW、EWP組顯著低于GF組(P<0.05)。60日齡時，EW、EWP組犢牦牛IGF-1水平顯著高于GF組(P<0.05)。90日齡時，EW、EWP組犢牦牛血清IGF-1與T4濃度均顯著高于GF組，并且EWP組血清GH濃度顯著高于GF組(P<0.05)。

表4 各組犢牦牛血清激素水平測定結果

2.4 不同斷奶模式對犢牦牛血清免疫指標的影響

30日齡時，EW、EWP組犢牦牛血清IgA、IgG含量顯著低于GF組(P<0.05)。60日齡時，EW、EWP組IgG水平亦顯著低于GF組(P<0.05)。90日齡時，EW、EWP組犢牦牛血清IgA水平顯著高于GF組(P<0.05)，IgG、IgM水平在3組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 各組犢牦牛血清免疫指標測定結果

2.5 不同斷奶模式對犢牦牛血清抗氧化指標的影響

由表6可知，30日齡時，EW組犢牦牛血清SOD活性顯著低于GF、EWP組(P<0.05)。60日齡時，EW、EWP組GSH水平顯著高于GF組犢牦牛(P<0.05)。EWP組犢牦牛血清CAT活性在90日齡時顯著高于GF組(P<0.05)。

表6 各組犢牦牛血清抗氧化指標測定結果

續(xù)表

3 討 論

3.1 不同斷奶模式對犢牦牛生長發(fā)育的影響

本研究結果顯示，斷奶早期(30日齡)EW、EWP組犢牦牛生長發(fā)育低于GF組，犢牦牛表現(xiàn)出一定的斷奶應激負面影響。在研究過程中筆者也觀測到，在斷奶早期適應階段犢牦牛的代乳粉采食量較低，制約了犢牦牛的生長發(fā)育速度。Lamb等[10]對15日齡肉犢牛進行為期28 d的試驗發(fā)現(xiàn)，早期斷奶組犢牛增重顯著低于隨母哺乳組，與本研究結果相似。本試驗中，隨著斷奶應激的逐漸恢復，至60、90日齡時，EW、EWP組犢牦牛生長發(fā)育速度加快，各項生長發(fā)育指標與GF組已無顯著差異，至150日齡時，EW、EWP組犢牦牛體重和體尺指標高于GF組，表現(xiàn)出更高的生長潛力，表明早期斷奶并補飼代乳粉和開食料，未對犢牦牛后期的生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響，其原因可能是斷奶后科學的飼養(yǎng)管理與營養(yǎng)供給，使正處于快速生長階段的犢牦牛獲得了充足的養(yǎng)分用于生長發(fā)育。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，可定植于動物體胃腸道，調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡。Timmerman等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在代乳粉中添加益生菌能顯著提高荷斯坦犢牛1～2周齡的日增重。Abe等[12]給新生荷斯坦犢?？诜秃弦嫔?假單孢雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌)，結果顯示試驗組犢牛增重和飼料轉化率均高于對照組。本試驗中，EWP組在30、60、90、150日齡時生長潛力均優(yōu)于EW組，提示復合益生菌可能在犢牦牛胃腸道產(chǎn)生益生作用，促進機體養(yǎng)分消化吸收，從而改善了犢牛的生長發(fā)育，該復合益生菌的作用效果與符運勤等[13]在荷斯坦奶犢牛上的報道一致。

3.2 不同斷奶模式對犢牦牛血清生化指標的影響

血清生化指標能夠反映動物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝情況[14]。GLU是機體能量的主要來源，對于犢牛各組織器官功能的發(fā)揮具有至關重要的作用[15]。本研究中，30日齡時，EW、EWP組血清GLU含量顯著低于GF組，可能與斷奶初期犢牦牛處于代乳粉適應期，采食量較低有關。60～90日齡時，隨著EW、EWP組犢牦牛適應代乳粉并開始采食開食料，碳水化合物攝入增加，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)為犢牦牛機體糖異生提供了更多底物，至90日齡時血清GLU含量顯著高于GF組，且以EWP組含量最高。有研究表明，補充酵母菌有利于瘤胃淀粉或纖維降解菌生長，促進了犢牛對飼糧碳水化合物的消化吸收，經(jīng)糖異生作用可生成更多葡萄糖[16]。本研究中,EWP組犢牦牛血清GLU水平升高，進一步表明添加復合益生菌可能會促進犢牦牛碳水化合物的消化吸收，進而增強機體糖異生能力。Blome等[17]研究發(fā)現(xiàn),犢牛血清BUN含量與攝入的蛋白質(zhì)水平呈正相關。本研究中，EW組犢牦牛血清BUN含量在30日齡時顯著低于GF組，而至90日齡時，EW、EWP組血清BUN含量均顯著高于GF組，推測與不同處理組犢牦牛蛋白質(zhì)攝入量有關。血清ALB和GLB組成TP，當血清TP含量升高時，有利于提高動物機體免疫力和蛋白質(zhì)代謝水平，改善動物健康，促進快速生長[18]。據(jù)報道，當肉牛犢牛處于應激狀態(tài)時，血清TP含量會顯著降低[19]，本研究中，30日齡時EW組血清TP含量顯著低于GF組，印證了犢牦牛早期斷奶應激的產(chǎn)生，也與本試驗中應激激素COR水平的變化相符。同時，Oskar等[20]研究發(fā)現(xiàn)，血清蛋白含量不僅與犢牛日齡相關而且與飼糧營養(yǎng)水平存在聯(lián)系。至60、90日齡時，各組血清TP含量已無顯著差異，表明斷奶后飼糧營養(yǎng)水平的提高促進了犢牦牛蛋白質(zhì)的攝入和吸收，達到了與母乳喂養(yǎng)同等的效果。血清TG和CHO含量是反映動物機體脂肪代謝的重要指標，血清TG含量的降低與脂質(zhì)沉積減少有關[21]。本研究結果表明，30日齡時，EW、EWP組TG和CHO含量均顯著低于GF組，至90日齡時EWP組血清TG含量顯著高于GF組，提示早期斷奶搭配復合益生菌有利于犢牦牛機體脂肪的吸收與利用。

3.3 不同斷奶模式對犢牦牛血清激素指標的影響

早期斷奶時犢牛由于自身的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，加之與母牛隔離和飼喂方式的變化，會產(chǎn)生一系列的心理和生理應激反應[22]。動物在應激刺激下血液中COR含量會發(fā)生明顯變化，被認為是評價動物應激程度的客觀指標。吳金節(jié)等[23]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬經(jīng)過心理應激(離開母豬)和營養(yǎng)應激(從吸吮母乳到完全采食干料)后，血清COR濃度極顯著升高。本研究也觀測到30日齡時EW組犢牦牛血清COR水平顯著高于GF組，證實早期斷奶和代乳粉適應期對犢牦牛產(chǎn)生了一定應激，也與本研究中的生長發(fā)育結果相符。而EWP組COR水平與GF組無顯著差異，表明添加復合益生菌對犢牦牛早期斷奶產(chǎn)生的應激有緩解作用。且研究表明，益生菌的抗應激效應機制主要與胃腸道微生物菌群和免疫力改善有關[24-25]。

GH由腦垂體前葉分泌，是調(diào)節(jié)動物生長最主要的激素之一，作為一種特殊的生物活性蛋白促進機體合成代謝和蛋白質(zhì)合成，而垂體產(chǎn)生的GH會作用于膜受體，然后刺激肝臟IGF-1生成，進而影響機體多個器官發(fā)育[26]；甲狀腺分泌的T3和T4則是垂體分泌GH所必需的，同時還能增強GH對組織的效應[27]。從本研究結果來看，30日齡時EW、EWP組的血清GH和IGF-1含量顯著低于GF組，提示斷奶早期產(chǎn)生的應激抑制了生長相關激素的分泌。60日齡時EW、EWP組血清IGF-1以及90日齡時IGF-1、T4水平均顯著高于GF組，這與柴建民[28]比較隨母哺乳與不同斷奶日齡的羔羊飼喂代乳粉的研究結果相近。有研究發(fā)現(xiàn)機體IGF-1水平受蛋白質(zhì)等營養(yǎng)攝入的顯著影響[29]。由此推測，本研究中早期斷奶在初期影響了犢牦牛的生長發(fā)育，但隨著斷奶應激的逐漸恢復，以及犢牦牛對代乳粉和開食料營養(yǎng)物質(zhì)的攝入，促進了犢牦牛生長相關激素的分泌。在90日齡時，EWP組犢牦牛血清GH水平為3組間最高，顯著高于GF組，表現(xiàn)出更大的生長潛力。何振富等[30]在舍飼肉牛飼糧中添加芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌復合益生菌，發(fā)現(xiàn)血清GH、IGF-1水平顯著升高，與本研究結果一致。其機制可能是益生菌通過改善胃腸道微生物的菌群，以短鏈脂肪酸、微生物模擬激素如生長激素抑制素、IGF-1樣多肽的直接作用，或胃腸道內(nèi)環(huán)境、免疫系統(tǒng)等間接作用影響機體GH、IGF-1激素軸分泌[31]。

3.4 不同斷奶模式對犢牦牛血清免疫指標的影響

血清免疫球蛋白在機體的體液免疫中發(fā)揮著重要作用，主要由IgG、IgA和IgM組成，由釋放抗體的B淋巴細胞介導[32]。母乳是幼齡動物早期最主要的被動免疫來源，本研究中，30日齡時犢牦牛血清IgA、IgG含量以及60日齡時血清IgG含量均表現(xiàn)為EW、EWP組顯著低于GF組，但至90日齡時，EW、EWP組血清IgA含量顯著高于GF組，而血清IgG和IgM含量在3組之間無顯著差異。鮑宇紅等[33]、王美美等[34]研究表明，飼糧營養(yǎng)水平可直接影響幼齡動物機體免疫球蛋白分泌，提高飼糧脂肪、蛋白質(zhì)水平能夠顯著提高血清免疫球蛋白水平。脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素等輸入性營養(yǎng)在刺激并激活機體免疫系統(tǒng)功能方面發(fā)揮關鍵作用[35]。這與本研究中早期斷奶犢牦牛補飼代乳粉與開食料，攝入養(yǎng)分更充足、均衡，血清IgA濃度得到顯著提升的結果一致。

3.5 不同斷奶模式對犢牦牛血清抗氧化指標的影響

血清抗氧化物質(zhì)是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，正常情況下，動物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，該平衡狀態(tài)與動物的健康狀況密切相關[36]。血清GSH、CAT和SOD是機體內(nèi)主要的抗氧化物酶，SOD和GSH可以反映機體消除自由基的能力，CAT在清除自由基中發(fā)揮重要作用，MDA是脂質(zhì)過氧化物，反映了機體受自由基攻擊的損傷程度。本研究中，犢牦牛血清GSH水平在60日齡時EW、EWP組顯著高于GF組；且EWP組犢牦牛在30日齡時血清SOD活性顯著高于EW組，90日齡時血清CAT酶活顯著高于GF組，表明復合益生菌有提高早期斷奶犢牦?？寡趸芰Φ淖饔?。李洵[37]報道，在3月齡斷奶公犢牛(黃牛)飼糧中添加不同水平的復合酵母菌、枯草芽孢桿菌，能夠顯著提高犢牛血清GSH水平。李敬芳等[38]研究發(fā)現(xiàn)，補飼乳酸桿菌、乳雙歧桿、酵母菌復合益生菌后小鼠血清SOD活性顯著增加，與本研究結果相符。益生菌與機體抗氧化能力的互作機制可能是：復合益生菌在犢牛胃腸道內(nèi)的定植有助于幼齡動物腸道微生態(tài)環(huán)境建立與胃腸道菌群結構改善，進而通過微生物源抗氧化酶、抗氧化代謝物、益生菌螯合金屬離子、調(diào)控宿主抗氧化酶、代謝物合成及相關信號通路等途徑，促進機體建立抗氧化防御機制[39]。

4 結 論

本研究證實了早期斷奶在犢牦牛培育上應用的可行性。犢牦牛在斷奶初期(30日齡)因斷奶應激而表現(xiàn)出一定負面影響，但斷奶后補飼代乳粉與開食料有利于改善犢牦牛(60～90日齡)的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和機體免疫與抗氧化能力；在補飼的同時補充復合益生菌有助于緩解犢牦牛斷奶應激，進一步促進犢牦牛的生長發(fā)育、提升抗氧化能力。