沃野千里，高 鐸，馬峰濤，金宇航，劉 茁，孫 鵬

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050000)

鋅是滿足犢牛生長的必需微量元素，幾乎所有基本的生命活動(細胞增殖和分化[1]、DNA修飾[2]、ATP酶活性[3]和糖脂代謝[4]等)所需的蛋白質(zhì)和酶都直接或間接依賴鋅元素的參與，因此鋅元素也被譽為“生命之花”。新生時期的犢牛處于生長發(fā)育的關鍵階段，此時機體的生長發(fā)育亟需鋅的參與[5]。在缺鋅狀態(tài)下，犢牛會表現(xiàn)出生長緩慢、骨骼發(fā)育不良、精神頓郁和食欲減退等癥狀[6]，并且可能導致腹瀉和呼吸道疾病[7]，嚴重影響犢牛健康，間接提高奶牛的淘汰率，造成巨大的經(jīng)濟損失。在通常情況下，牛乳中的鋅元素能夠基本滿足犢牛生長發(fā)育和代謝的需要，然而除了從牛乳中攝取的鋅以外，在飼糧中額外添加適宜水平的鋅能夠改善犢牛鋅代謝水平，有利于增強犢?？寡趸瘷C能，降低腹瀉率[8-9]。

由于鋅具有改善畜禽生長性能、抗菌、抗炎、抗應激和增強免疫力等功能[10-11]，鋅元素已被廣泛應用為飼料添加劑。鋅添加劑主要分為無機鋅添加劑和有機鋅添加劑兩大類，無機鋅添加劑主要有傳統(tǒng)的氧化鋅，以及新型的納米氧化鋅和多孔氧化鋅等[12-13]。有機鋅添加劑主要是鋅離子和有機螯合體(蛋白質(zhì)、氨基酸和小肽等)通過共價鍵形成的螯合物，主要有氨基酸螯合鋅、蛋白鋅和酵母鋅等[14]。

傳統(tǒng)無機鋅的生物利用率較低，飼喂動物會導致糞尿中排放的鋅含量升高，造成環(huán)境污染，因此，2017年頒布的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2625號《飼料添加劑安全使用規(guī)范》禁止了飼糧中高劑量氧化鋅的使用。有機鋅源是一類新型、高效的鋅添加劑。蛋白鋅主要是由鋅離子與分離的大豆蛋白螯合產(chǎn)生的一種鋅蛋白鹽[15]。蛋白鋅的制備工藝簡單，原料和生產(chǎn)成本相對較低，目前多用水體系合成法來生產(chǎn)，有助于克服傳統(tǒng)無機鋅源生物利用率低、疏水性高和破壞飼料營養(yǎng)成分等缺點，且其成本通常低于蛋氨酸鋅，是一種有前景的飼料添加劑[16]。蛋氨酸鋅是蛋氨酸和無機鋅通過酸堿中和法在一定的溫度和壓力下生成的有機螯合鋅[17]，蛋氨酸鋅是一種高效的自由基清除劑，能夠緩解脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽消耗和DNA片段化等氧化應激造成的損傷[18]，其應用在飼糧中能夠提高生長性能，改善免疫功能，降低腹瀉率[19]。與傳統(tǒng)的氧化鋅相比，有機鋅生物利用率更高，具有高穩(wěn)定性、易吸收等優(yōu)勢，能夠降低鋅元素添加過量造成的環(huán)境污染[20-21]。前人的研究表明，在新生犢牛飼糧中添加有機鋅源，能夠提高犢牛日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，降低腹瀉率和改善腸道屏障功能[22]，對于改善新生犢牛健康具有重要意義。

中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所家畜營養(yǎng)與調(diào)控科技創(chuàng)新團隊的前期研究表明，在新生犢牛飼糧中添加鋅元素的最適劑量為80 mg/d[9]，并且與氧化鋅相比，蛋白鋅和蛋氨酸鋅均具有更高的生物利用率[23-24]，但是目前不同有機鋅源對新生犢牛的促生長效果和鋅吸收效率仍有待研究。因此，本試驗在新生犢牛飼糧中分別以蛋白鋅和蛋氨酸鋅的形式添加80 mg Zn/d，測定其對1～14日齡犢牛生長性能和腹瀉率、血清礦物元素和鋅代謝指標的影響，旨在比較不同有機鋅源對新生犢牛早期生長性能和腹瀉率及機體鋅代謝的影響，篩選更加有效的有機鋅源，為其在犢牛飼養(yǎng)中的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2020年10月至2020年11月在河北省邢臺市君興牧業(yè)有限公司開展。

1.2 材料

蛋氨酸鋅購自北京市某生物科技有限公司，純度≥95.00%；蛋白鋅[螯合強度(Qf)為357，鋅含量為15.30%]由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所礦物元素研究室饋贈。

1.3 試驗動物與分組

根據(jù)體重、胎次相近原則，選取30頭新生荷斯坦母犢牛(體重39.4 kg±0.8 kg)，隨機分成3個處理組，每組10個重復，每重復1頭牛。對照組(CON)只飼喂牛乳，不添加有機鋅源添加劑；蛋白鋅組(Zn-Pro)在飼喂牛乳的基礎上，每頭牛額外飼喂522.82 mg/d的蛋白鋅(相當于80 mg Zn/d)；蛋氨酸鋅組(Zn-Met)在飼喂牛乳的基礎上，每頭牛額外飼喂467.88 mg/d的蛋氨酸鋅(相當于80 mg Zn/d)。

1.4 飼糧與犢牛飼養(yǎng)管理

在每頭犢牛出生后，立即將其從母牛分娩舍中取出，放入犢牛島單欄飼養(yǎng)。所有犢牛在出生后1 h內(nèi)灌胃4 L初乳。1～14日齡期間，每頭犢牛每天飼喂2次常乳(08：00、20：00)，每次4 L，每天共8 L，試驗期間不飼喂犢牛開食料。在飼喂不同鋅源添加劑時，首先將蛋白鋅或蛋氨酸鋅與200 mL牛乳混合后飼喂給犢牛，待完全采食之后，再繼續(xù)將牛乳飼喂給犢牛，每日計算牛奶采食量。采用乳成分分析儀(MilkoScanTMFT-6000)測定牛乳的密度、蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和總固形物含量(表1)。試驗從犢牛生后1日齡起，至14日齡結(jié)束，試驗期14 d。

表1 乳成分

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 生長性能和腹瀉率測定 每頭犢牛在1、14日齡晨飼前，測量體重，并計算平均日增重(average daily gain，ADG)。根據(jù)牛乳采食量，計算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比。每天晨飼前，由專人觀察犢牛糞便形態(tài)，進行糞便評分，評分標準參考Ma[23]等研究：糞便正常，呈圓柱形記1分；糞便成型，但輕微稀軟記2分；糞便液狀不成型，但顏色正常(黃色)記3分；糞便水分含量高，顏色不正常(綠色、紅色)記4分。糞便指數(shù)為3、4分的犢牛記為腹瀉，試驗結(jié)束后，統(tǒng)計總腹瀉犢牛數(shù)和腹瀉天數(shù)，根據(jù)公式計算腹瀉率：腹瀉率(%)=[總腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)/(試驗犢牛數(shù)×總試驗天數(shù))]×100。

1.5.2 血清樣品采集 每頭犢牛在14日齡晨飼前，使用真空采血管于頸靜脈穿刺獲得血樣，將血樣放入高速冷凍離心機(Eppendorf 5810R)，在4 ℃下以3 000×g離心15 min，收集血清并儲存于-80 ℃以備測定。

1.5.3 礦物元素濃度 根據(jù)中國國家標準(GB 5009.268—2016)所述，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)測定血清中的鈣、磷、鋅、銅和鐵濃度。

1.5.4 血清鋅代謝指標 血清中的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)濃度，均使用商業(yè)試劑盒檢測(南京建成生物工程研究所)。血清中的金屬硫蛋白(metallothionein，MT)濃度采用ELISA試劑盒測定(武漢基因美生物科技有限公司)。上述所有試驗操作均按照試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理，腹瀉率采用卡方檢驗進行分析，使用SAS 9.4軟件對生長性能、血清礦物元素和鋅代謝指標的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，采用Tukey法進行多重比較，數(shù)據(jù)以最小二乘均值和標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛生長性能和腹瀉率的影響

如表2所示，與對照組相比，飼糧中添加蛋氨酸鋅顯著提高了犢牛的ADG(P<0.05)；蛋白鋅組犢牛的ADG與對照組和蛋氨酸鋅組相比差異均不顯著(P>0.05)。兩種有機鋅源對犢牛平均日采食量和料重比均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，蛋白鋅和蛋氨酸鋅組犢牛1～14 d腹瀉率均顯著降低(P<0.05)。

表2 各組荷斯坦犢牛生長性能和腹瀉率

2.2 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛血清礦物元素的影響

如表3所示，與對照組相比，添加蛋白鋅和蛋氨酸鋅均能顯著提高犢牛血清中的鋅濃度(P<0.05)，且蛋氨酸鋅組犢牛血清中的鋅濃度顯著高于蛋白鋅組(P<0.05)。蛋白鋅組犢牛血清中的銅濃度與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。與對照組和蛋白鋅組相比，蛋氨酸鋅組犢牛血清中的銅濃度顯著降低(P<0.05)。不同有機鋅源對犢牛血清中的鈣、磷和鐵濃度均無顯著影響(P>0.05)。

表3 各組荷斯坦犢牛血清礦物元素濃度

2.3 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛血清鋅代謝指標的影響

如表4所示，與對照組相比，飼糧中添加蛋白鋅對犢牛血清中ALP活性、SOD活性和T-AOC均無顯著影響(P>0.05)，但能夠顯著增加血清中MT濃度(P<0.05)，降低血清中MDA濃度(P<0.05)；添加蛋氨酸鋅顯著提高了犢牛血清中ALP活性、MT濃度、SOD活性和T-AOC(P<0.05)，顯著降低了血清中的MDA濃度(P<0.05)。

表4 各組荷斯坦犢牛血清鋅代謝指標測定結(jié)果

3 討 論

3.1 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛生長性能和腹瀉率的影響

新生時期的犢牛處于生長發(fā)育的重要階段，此階段犢牛生長性能良好對于發(fā)揮奶牛泌乳潛能具有積極意義[25]。新生時期犢牛的免疫功能較為脆弱，特別是在出生后前2周，犢牛血液中的免疫球蛋白含量逐漸降低，容易發(fā)生生長遲緩及腹瀉等問題[26]。由于圍產(chǎn)期奶牛飼糧中含鋅，新生犢牛的缺鋅狀況較少，然而，在飼糧中補充鋅能夠緩解新生犢牛腹瀉[9,19]，因此，有必要在1～14日齡犢牛飼糧中額外添加適當水平的鋅以促進犢牛生長，降低腹瀉率。

ADG是衡量新生犢牛生長性能最重要的指標之一。已有研究表明，飼糧中以蛋白鋅形式添加80 mg Zn/d能夠提高犢牛生長性能，且其效果與添加180 mg Zn/d的氧化鋅相當[24]。犢牛飼糧中添加鋅含量為80 mg/d的蛋氨酸鋅能夠提高犢牛8～14日齡的ADG，降低料重比，且其生物利用率高于氧化鋅[23]；Chang等[19]研究表明，蛋氨酸鋅能夠提高1～14日齡犢牛的ADG。本試驗結(jié)果表明，添加蛋氨酸鋅提高了1～14日齡犢牛ADG，與上述研究結(jié)果一致。

犢牛的飼糧、免疫以及飼養(yǎng)管理等因素均可能引發(fā)腹瀉，導致犢牛采食量下降、生長遲緩，并且降低奶牛未來的產(chǎn)奶性能[27]。飼糧中添加不同劑量的氧化鋅能夠線性降低1～14日齡犢牛腹瀉率[9]。與氧化鋅的效果類似，飼喂有機鋅能夠降低畜禽的腹瀉率，Glover等[28]表明，在腹瀉期間犢牛體重減輕了67 g/d，而飼喂蛋氨酸鋅的腹瀉犢牛體重增加了40 g/d。Feldmann等[8]研究表明，與對照組相比，蛋氨酸鋅組犢牛腹瀉率降低14.7%。在犢牛飼糧中添加不同劑量的蛋白鋅能夠降低犢牛糞便指數(shù)，且其效果與添加高劑量氧化鋅相當[24]。與上述研究結(jié)果一致，本試驗結(jié)果表明，添加蛋白鋅和蛋氨酸鋅均顯著降低了犢牛腹瀉率。這可能與有機鋅源提高腸道黏膜絨毛長度及緊密連接蛋白表達量有關，Ma等[22]發(fā)現(xiàn)蛋氨酸鋅能夠顯著降低1～14日齡犢牛D-乳酸含量，提高空腸黏膜絨毛長度，并且提高連接蛋白(claudin)、閉鎖蛋白(occludin)和閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)的mRNA表達，且其效果優(yōu)于氧化鋅。

本試驗中蛋氨酸鋅改善生長性能的效果優(yōu)于蛋白鋅，這可能是由于蛋氨酸鋅組犢牛的平均腹瀉率低于蛋白鋅組，且蛋氨酸鋅具有良好的化學穩(wěn)定性及較高的生物利用率，更加適合犢牛吸收，同時蛋氨酸是滿足生長所需的必需氨基酸之一，本身具有潛在的促生長作用[29]，蛋氨酸與鋅螯合后可能更加有利于鋅的吸收，從而產(chǎn)生更好的促生長功效。

3.2 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛血清中礦物元素的影響

由于畜禽自身無法合成鋅元素，因此所需鋅只能通過飼糧攝取。有機鋅能夠提高消化系統(tǒng)對鋅的吸收和轉(zhuǎn)運能力，與無機鋅相比，有機鋅在細胞膜上具有更高的溶解速率和通過率，有機配體能夠保護Zn2+免受植酸、單寧和棉酚等物質(zhì)的結(jié)合，并且有機鋅能夠通過氨基酸轉(zhuǎn)運途徑吸收進入細胞，避免金屬離子之間的吸收頡頏[30]，因此，有機鋅源比無機形式具有更高的生物利用率[26]。Kincaid等[31]發(fā)現(xiàn)，在犢牛飼糧中添加有機鋅(蛋氨酸鋅、賴氨酸鋅等)能夠提高犢牛肝臟中的鋅含量。金宇航等[24]研究表明，犢牛飼糧中添加蛋白鋅(>80 mg Zn/d)能夠顯著提高14日齡犢牛血漿中的鋅含量，而在飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠提高14日齡犢牛血清和肝臟中鋅的含量[32]。與上述結(jié)果一致，本試驗結(jié)果表明，蛋氨酸鋅和蛋白鋅均能顯著提高血清中鋅濃度，且蛋氨酸鋅組高于蛋白鋅組。蛋白鋅相對略低的吸收率可能與其螯合強度有關。Huang等[33]發(fā)現(xiàn)，蛋白鋅的生物利用度與其Qf密切相關。本研究中使用的蛋白鋅的Qf=357，低于Huang等[33]采用的蛋白鋅的Qf(944)。因此，需要進一步研究不同Qf的蛋白鋅對犢牛鋅吸收效率的影響。另外，當攝入的鋅、銅元素在抵達小腸絨毛刷狀緣時，可能會相互競爭吸收載體和結(jié)合位點，導致鋅銅頡頏吸收[34]，因此當機體鋅水平過高時容易導致低銅血癥，出現(xiàn)生長緩慢和骨骼發(fā)育不良等癥狀。但在本試驗中，蛋白鋅組在顯著提高鋅濃度的同時，其血清中銅濃度也顯著高于蛋氨酸鋅組和對照組。推測補充蛋白鋅有助于緩解鋅和銅之間的頡頏關系，在提高血清中鋅濃度的同時避免血清銅濃度過度下降。Ao等[15]的研究結(jié)果也同樣表明，蛋白鋅有利于提高十二指腸黏膜中的銅濃度，從而緩解鋅和銅之間的頡頏作用。在本試驗中添加有機鋅源未影響血清中鈣、磷和鐵的濃度，與前人研究結(jié)果[35]一致。

3.3 不同有機鋅源對荷斯坦犢牛血清鋅代謝指標的影響

鋅是維持鋅依賴酶和鋅結(jié)合蛋白結(jié)構的關鍵因子，這些酶和蛋白在機體鋅代謝中扮演重要角色。為進一步研究有機鋅源對新生犢牛鋅代謝的影響，本試驗檢測了犢牛血清中的鋅依賴酶與鋅結(jié)合蛋白的含量。ALP是一種含鋅的磷酸酶，能夠去除核酸和蛋白質(zhì)等大分子上的磷酸基團產(chǎn)生羥基和磷酸根離子，ALP的活性常被用于反映機體的鋅水平[36]。已知添加鋅元素能夠增加犢牛血清中ALP活性[37]，在犢牛飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠提高14日齡犢牛血清中ALP活性[23]。在本試驗中蛋氨酸鋅顯著提高了血清ALP活性，結(jié)果與上述試驗一致。MT是一種具有高親和力的鋅銅結(jié)合肽，其分泌受到鋅水平調(diào)控，是維持細胞內(nèi)鋅濃度的緩沖物質(zhì)，MT也是能夠反映鋅水平的生物標志物[38]。研究證明，犢牛飼糧中添加鋅可以提高其肝臟中的MT濃度[39]，而添加蛋氨酸鋅能夠增加血清中MT濃度[23]。本試驗結(jié)果表明，添加有機鋅均可提高犢牛血清中MT濃度，這一結(jié)果與上述研究一致。另外，MT不僅可以作為反映鋅水平的生物標志物，還能夠充當機體的抗氧化物[38]，有研究表明MT的抗氧化活性高于SOD和谷胱甘肽過氧化物酶[40]。飼糧中添加蛋氨酸鋅增加了犢牛血清MT濃度[24]，因此MT濃度上升可能與蛋氨酸鋅提高了血清抗氧化性能有關。

SOD是一種含鋅的抗氧化金屬酶，對于清除自由基具有顯著效果，但其活性受到機體鋅水平的調(diào)控，因為SOD的活性中心含有鋅離子，鋅起到穩(wěn)定活性中心的作用。有研究證明，犢牛血清中SOD活性隨鋅添加劑量的提高線性升高[9]。Dresler等[32]研究表明，飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠增強機體的抗氧化能力，提高斷奶犢牛血清中SOD活性。另外，Chen等[41]試驗表明，飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠提高奶牛血清中T-AOC的含量。在本研究中，蛋氨酸鋅同時提高了犢牛血清中SOD活性及T-AOC濃度，與前人研究結(jié)果一致，表明蛋氨酸鋅有利于提高犢牛機體的抗氧化能力?；钚匝跏羌毎x產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，當活性氧的生成超過自身抗氧化能力時，就會引發(fā)氧化應激[42]，其中MDA是氧化應激狀態(tài)下脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，因此常被用于評價機體的氧化應激狀態(tài)。研究表明，犢牛血清中MDA含量隨飼糧中鋅添加量的增加而線性降低[9]，Alimohamady等[43]研究表明添加蛋白鋅和蛋氨酸鋅可降低反芻動物血清中MDA濃度。在本試驗中，添加蛋白鋅和蛋氨酸鋅降低血清MDA濃度，以上結(jié)果表明，犢牛日糧中補充有機鋅源有利于提高機體的抗氧化能力，其機制可能是鋅通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路從而增強抗氧化酶基因表達[44]，有待于進一步探究。

4 結(jié) 論

飼糧中以蛋氨酸鋅的形式添加80 mg Zn/d顯著提高了1～14日齡犢牛的平均日增重；兩種有機鋅均能提高犢牛血清中的鋅濃度，降低犢牛腹瀉率，均有利于改善犢牛血清中的鋅代謝相關指標。本試驗條件下，蛋氨酸鋅的作用效果優(yōu)于蛋白鋅，但蛋白鋅生產(chǎn)成本更低，更有利于推廣應用。