彭志蘋(píng)，張景艷，郭志廷，王 磊，張 凱，張 康，王貴波，仇正英，王學(xué)智，李建喜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris(Linn.) Link.)又稱(chēng)北蟲(chóng)草、蛹草、蛹草菌，為麥角菌科蟲(chóng)草屬，性平味甘，入肺、腎二經(jīng)，具有補(bǔ)精益髓、潤(rùn)肺補(bǔ)腎、止咳化痰等功效[1-2]。研究證明，蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)成分和藥理作用相似，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-5]。蛹蟲(chóng)草最初發(fā)現(xiàn)于自然界，目前已實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化人工培養(yǎng)，以固體培養(yǎng)方式為主，培養(yǎng)基由大米、小麥、高粱等組成，子實(shí)體采摘后，會(huì)剩余大量培養(yǎng)殘基[6]。這些培養(yǎng)殘基長(zhǎng)滿菌絲體，內(nèi)含子實(shí)體相同的蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等有效成分，具有二次開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。實(shí)際生產(chǎn)中，蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基開(kāi)發(fā)利用較少，大部分被丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，因此迫切需要開(kāi)展其有效成分的提取研究[7]。據(jù)報(bào)道，蛹蟲(chóng)草活性成分提取方法主要有水熱回流法、浸提法、醇熱回流法、超聲波法、超聲波輔助酶提取法等[8-9]，其中水熱回流法提取工藝簡(jiǎn)單，具有不使用有機(jī)溶劑、成本低、便于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。雖然，王英娟等[10]和雷燕妮等[11]分別將水熱回流法用于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和菌渣中有效成分提取，建立了相關(guān)工藝流程和參數(shù)，但因蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基配方存在差異，針對(duì)不同培養(yǎng)殘基中有效成分提取的相關(guān)參數(shù)還需進(jìn)一步篩選與優(yōu)化。影響水熱回流法提取中藥有效成分的主要因素包括粉碎粒度大小、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和液料比等[12]。鑒于此，本研究以液料比、提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化水熱回流法提取蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基蟲(chóng)草素的工藝，并利用高效液相色譜測(cè)定法(high-performance liquid chromatography，HPLC)對(duì)提取物中蟲(chóng)草素含量進(jìn)行驗(yàn)證，以期為蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基由山東奧美生物工程有限公司提供。蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)。

U-3000高效液相色譜儀(戴安中國(guó)有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LGJ-10F真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；ZNCLT-500系列磁力攪拌器(上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司)；CS-2000高速多功能粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)；Allegra X-15R貝克曼臺(tái)式冷凍離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司)。

1.2 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取工藝流程

蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩，稱(chēng)取適量粉末于三口燒瓶中，按相應(yīng)比例加入蒸餾水，置電熱套上，加熱回流，室溫冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀按相同程序重復(fù)提取。合并上清液，攪拌濃縮至200 mL，冷卻至室溫后―80 ℃預(yù)凍，真空冷凍干燥后備用。

1.3 HPLC測(cè)定提取物中蟲(chóng)草素含量

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116—2012蟲(chóng)草制品中蟲(chóng)草素和腺苷測(cè)定[13-14]。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取0.0500 g樣品于容量瓶中，加適量超純水溶解，超聲30 min，定容至10 mL。取1 mL樣液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱(chēng)取蟲(chóng)草素和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品各2.50 mg，超純水溶解，定容至25 mL，搖勻。該混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中蟲(chóng)草素和腺苷的質(zhì)量濃度均為100 mg/L，4 ℃保存。分別準(zhǔn)確取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，超純水定容至10 mL，濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 mg/L。依據(jù)色譜測(cè)定條件，以蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度 吸取1 mL供試品溶液，在相同色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積測(cè)量值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD≤2%。

1.3.5 重復(fù)性 分別制備供試品溶液6份，在相同色譜條件下各進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積測(cè)量值RSD，RSD≤2%。

1.3.6 穩(wěn)定性 吸取1 mL供試品溶液，在相同色譜條件下，于0、2、4、6、8、10、12、18和24 h各進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積測(cè)量值RSD，RSD≤2%。

1.3.7 準(zhǔn)確度 分別制備供試品溶液9份，每份準(zhǔn)確吸取5 mL供試品溶液于10 mL容量瓶，分別按照標(biāo)準(zhǔn)品加入量與所取供試品中待測(cè)成分量1.5∶1、1∶1、0.5∶1配制，得到濃度分別為150%、100%、50%(M/M)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次。在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣1次，計(jì)算回收率。

回收率(%)=(供試品實(shí)測(cè)成分量―供試品原成分量)/對(duì)照品加入量×100%

以護(hù)理前后ADL評(píng)分、FMA評(píng)分為評(píng)比項(xiàng)進(jìn)行對(duì)比。日常生活活動(dòng)能力（ADL）評(píng)分，總分100分，＞61分表示日常生活活動(dòng)能力有輕度的功能損害，41～60分表示中度損害，＜40分表示重度損害。簡(jiǎn)式Fugl－Meyer評(píng)測(cè)法（FMA）評(píng)分，進(jìn)行上肢、下肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)定，運(yùn)動(dòng)功能程度與分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。

1.3.8 結(jié)果計(jì)算 按照保留時(shí)間定性，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間RSD≤2%，多點(diǎn)校正外標(biāo)法定量。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣品質(zhì)量濃度(mg/L)，試驗(yàn)樣品中蟲(chóng)草素含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，單位以mg/g表示，按以下公式計(jì)算。

ω=ρ×V×m2/(m1×M×1000)

式中，ρ，供試品中蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度(mg/L)；V，供試品最終體積(mL)；m1，供試品質(zhì)量(g)；m2，水提物的質(zhì)量(g)；M，蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基的質(zhì)量(g)。

1.4 單因素考察蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取工藝

按照1.2方法分別考察液料比、提取次數(shù)、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取工藝的影響。各因素考察水平如下：液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)，按照1.3方法測(cè)定各因素水平下蟲(chóng)草素含量，每個(gè)水平重復(fù)3次。

1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。選用L9(34)正交設(shè)計(jì)模型，選擇4個(gè)因素：液料比(A)、提取次數(shù)(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)，各因素間不考慮交互作用，每個(gè)因素各有3個(gè)水平(表1)。分別取9份10.0 g蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基，按1.2和1.3方法提取并測(cè)定提取物中蟲(chóng)草素含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

表1 影響蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取的因素及水平

1.6 提取回收率試驗(yàn)

分別稱(chēng)取2.0 g已知含量的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基12份，按照蟲(chóng)草素對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)成分量之比1.5∶1、1∶1、0.5∶1、0∶1配制，得到濃度分別為150%、100%、50%、0(W/W)的溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定的提取工藝制備供試品溶液。在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣1次，計(jì)算回收率及RSD。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析和正交設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 各取3份混合對(duì)照品溶液、蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基供試品溶液和空白溶劑，分別開(kāi)展HPLC試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，樣品中蟲(chóng)草素的分離度和理論塔板數(shù)良好，分離度>1.5，理論塔板數(shù)>12 000，不對(duì)稱(chēng)因子在1.00～1.20之間，且沒(méi)有陰性干擾。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)、供試品(B)和空白溶劑(C)的HPLC色譜圖

2.1.2 線性范圍 以蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，蟲(chóng)草素的線性回歸方程為：y=0.6888x-0.1629，R2=0.9999。表明蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度在1.00～100 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好。

圖2 蟲(chóng)草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 由表2可知，同一供試品溶液重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素峰面積為18.75 mAU*min，RSD為0.85%，表明儀器精密度良好；同一批次的6個(gè)供試品溶液各測(cè)定1次，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素峰面積為18.72 mAU*min，RSD為0.46%，表明方法重復(fù)性良好；同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12、18和24 h時(shí)各測(cè)定1次，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素峰面積為18.43 mAU*min，RSD為1.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 HPLC方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)定

2.1.4 準(zhǔn)確度 取50%、100%、150%的供試品溶液，在相應(yīng)的色譜條件下各測(cè)定1次，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示，加樣回收率為103.55%，RSD為2.64%(表3)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 HPLC方法的準(zhǔn)確度測(cè)定

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比 由圖3A可知，隨著液料比的增加，蟲(chóng)草素含量呈先上升后下降趨勢(shì)。在液料比為20∶1時(shí)，蟲(chóng)草素含量達(dá)到最高，為1.32 mg/g，顯著高于液料比5∶1和10∶1(P<0.05)，與液料比15∶1和25∶1時(shí)差異不顯著(P>0.05)。故選擇20∶1為最佳液料比，確定正交設(shè)計(jì)中液料比的3個(gè)水平分別為15∶1、20∶1和25∶1。

2.2.2 提取次數(shù) 由圖3B可知，蟲(chóng)草素含量隨著提取次數(shù)增加而增加。在提取5次時(shí)，蟲(chóng)草素含量最高，為1.34 mg/g，顯著高于提取1、2和3次(P<0.05)，與提取4次差異不顯著(P>0.05)。故選擇5次為最佳提取次數(shù)，確定正交設(shè)計(jì)提取次數(shù)的3個(gè)水平分別為3、4和5次。

2.2.3 提取溫度 由圖3C可知，蟲(chóng)草素含量隨著提取溫度增加而下降，至90 ℃時(shí)蟲(chóng)草素含量最低；提取溫度為70 ℃時(shí)，蟲(chóng)草素含量最高，為1.22 mg/g，顯著高于90 ℃(P<0.05)，與其他3個(gè)提取溫度均差異不顯著(P>0.05)。故選擇最佳提取溫度為70 ℃，確定正交設(shè)計(jì)中提取溫度的3個(gè)水平分別為60、70和80 ℃。

2.2.4 提取時(shí)間 由圖3D可知，蟲(chóng)草素含量在不同提取時(shí)間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。在提取時(shí)間為60 min時(shí)，蟲(chóng)草素含量最高，為1.11 mg/g。故選擇最佳提取時(shí)間為60 min，確定正交設(shè)計(jì)中提取時(shí)間的3個(gè)水平分別為60、90和120 min。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)液料比(A)、提取次數(shù)(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。由表4的極差分析可知，在選定的試驗(yàn)范圍內(nèi)，影響蟲(chóng)草素含量的因素主次順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>提取次數(shù)>液料比>提取溫度，因素水平的最佳參數(shù)組合為A3B3C1D1。由表5的方差分析可知，提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草素含量有顯著影響(P<0.05)，提取溫度和液料比對(duì)蟲(chóng)草素含量影響不顯著(P>0.05)。表明影響蟲(chóng)草素含量的因素水平的最佳參數(shù)組合為B3D1，即最佳提取次數(shù)5次、提取時(shí)間60 min，液料比和提取溫度對(duì)提取工藝影響較少。綜合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，確定最佳提取工藝參數(shù)的液料比為25∶1、提取次數(shù)為5次、提取溫度為70 ℃和提取時(shí)間為60 min。

表4 正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表5 正交設(shè)計(jì)的方差分析

2.4 提取回收率試驗(yàn)

由表6可知，在最佳提取條件下，測(cè)得蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素含量為1.48 mg/g；50%、100%、150%的供試品溶液在相應(yīng)的色譜條件下各進(jìn)樣1次，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素的平均提取回收率為92.56%，RSD為4.54%，表明蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基的提取工藝良好。

表6 提取回收率測(cè)定

3 討 論

蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基與其子實(shí)體一樣，含有蟲(chóng)草素、腺苷、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、超氧化物歧化酶、類(lèi)胡蘿卜素、凝集素、纖維蛋白溶解酶等多種有效成分，其中蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖關(guān)注度最高[4,15]。研究發(fā)現(xiàn)，采用柱層析方法對(duì)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基進(jìn)行提取、分離和純化，成功制備出高純度的蟲(chóng)草素[16]。本試驗(yàn)使用的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基原料為燕麥，內(nèi)含大量淀粉類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)在提取過(guò)程中會(huì)被分解為多糖，從而干擾蟲(chóng)草多糖測(cè)定，因此一般以檢測(cè)提取物中蟲(chóng)草素含量作為評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取工藝的指標(biāo)。蟲(chóng)草素的測(cè)定方法主要有分光光度法、薄層色譜掃描法和HPLC法等[17]。分光光度法和薄層色譜法操作簡(jiǎn)單、成本低，但檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差、誤差大；HPLC法具有重現(xiàn)性好、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、受樣品基質(zhì)影響小等優(yōu)點(diǎn)，是目前測(cè)定蟲(chóng)草屬中蟲(chóng)草素含量最常用的方法[17-18]。本研究參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13]，驗(yàn)證了蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基水提物中蟲(chóng)草素含量的HPLC測(cè)定方法，考察了該方法的專(zhuān)屬性、系統(tǒng)適用性、線性范圍、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素質(zhì)量濃度在1.00～100 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，這與李劍梅等[19]研究結(jié)果相近，表明該方法適用于蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基中目標(biāo)樣品的檢測(cè)。

中藥的現(xiàn)代提取方法包括超聲波法、加速溶劑萃取法、超高壓萃取法等，具有溶劑消耗少和提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但技術(shù)含量需求高、成本也高[8]，不易推廣普及。因此，中小企業(yè)更愿意選擇工藝流程簡(jiǎn)單、成本低的傳統(tǒng)提取方法，如浸提法和水熱回流法等[8]。中藥提取方法的選擇，還與提取物有效成分的極性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草素易溶于水、甲醇和熱乙醇，不溶于氯仿和乙醚等[20]；蟲(chóng)草多糖易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑和高濃度乙醇[21]，故常用水和乙醇為提取溶劑。Luo等[22]比較了水熱回流法和超聲提取法提取蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的蟲(chóng)草素，發(fā)現(xiàn)水熱回流法的蟲(chóng)草素提取率(95.02%)略低于超聲提取法(96.12%)。雷燕妮等[11]分別選用水和乙醇為提取溶劑，比較了熱回流法和超聲波輔助提取法對(duì)蛹蟲(chóng)草菌渣中蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖和蛋白質(zhì)得率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水熱回流法既可提取蛹蟲(chóng)草菌渣中蟲(chóng)草素，又可提取蟲(chóng)草多糖和蛋白質(zhì)。水熱回流法與超聲提取法相比，具有操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，但其提取率受提取物粒徑大小、溫度、時(shí)間、提取次數(shù)、液料比等提取因素的影響[11,23]。因此，學(xué)者們采用水熱回流法時(shí)常常會(huì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草素含量的影響顯著，而液料比和提取溫度影響不顯著，其中影響程度依次為提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比和提取溫度。常正姣[24]采用單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化雜糧蛹蟲(chóng)菌絲共生體的水浴提取條件，發(fā)現(xiàn)影響蟲(chóng)草素含量的3個(gè)因素主次順序?yàn)榻釙r(shí)間、液料比、浸提溫度，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相近。孟勝楠[25]采用水熱浸提法提取蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，在提取溫度63.3 ℃、提取時(shí)間4.8 h、液料比36.8∶1、提取液pH 6.7時(shí)，提取物中蟲(chóng)草含量最高，為1.32 mg/g。張麗艷[26]采用水熱浸提法提取蛹蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，在提取溫度40 ℃、提取次數(shù)4次、液料比為20∶1、提取時(shí)間2 h時(shí)，提取物中蟲(chóng)草素得率最高，為0.69%。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素的最佳提取工藝參數(shù)為液料比25∶1、提取次數(shù)5次、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間60 min，此條件下測(cè)得蟲(chóng)草素含量為1.48 mg/g，高于孟勝楠[25]研究結(jié)果。提取回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，在該工藝下蟲(chóng)草素回收率為92.56%，表明該提取工藝參數(shù)穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

此外，蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基提取方式不同，蟲(chóng)草素含量也會(huì)有一定差異。陳麗冰[7]分別用超高壓提取法、超聲波水提取法和閃式提取法提取北蟲(chóng)草培養(yǎng)基有效成分，結(jié)果顯示，北蟲(chóng)草培養(yǎng)基中蟲(chóng)草素含量分別為1.70、1.58和1.65 mg/g。石浩[27]比較了熱水-乙醇提取法、酸溶劑提取法、超聲協(xié)同酸溶劑提取法、超聲協(xié)同微波提取法對(duì)蛹蟲(chóng)草下腳料超微粉的提取效果，結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素含量分別為2.70、2.86、3.18和2.94 mg/g，與本試驗(yàn)結(jié)果有一定差異，原因可能在于：蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基中菌絲共生體含量不同[24]；蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基粉末粒度大小對(duì)蟲(chóng)草素得率影響較大[27]。由此可見(jiàn)，蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng)基組方不同、菌絲共生體含量不同、培養(yǎng)方式不同，其有效成分的提取方法也應(yīng)不同，水熱回流法是最常用方法之一。本研究確定的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基水熱回流法提取工藝參數(shù)穩(wěn)定，活性成分得率好，可為后續(xù)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基水提物產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

4 結(jié) 論

以蟲(chóng)草素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)液料比、提取次數(shù)、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素考察，得出蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基活性成分的水熱回流法最佳提取工藝參數(shù)為：液料比25∶1、提取次數(shù)5次、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間60 min，該條件下測(cè)得蟲(chóng)草素含量為1.48 mg/g。