譚皓云，劉 茜，胡德寶，張林林，李 新，丁向彬，郭 宏，郭益文

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

肌肉系統(tǒng)是維持動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育的重要基礎(chǔ)。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，如lncMAR1[1]、lncMALAT1[2]、lncMAAT[3]等。lncRNA曾因?yàn)橹挥袠O少數(shù)序列編碼蛋白質(zhì)、絕大部分編碼非蛋白質(zhì)而一度被認(rèn)為是基因組序列中累積的“垃圾產(chǎn)物”[4]。直到美國(guó)啟動(dòng)ENCODE研究計(jì)劃后人們才發(fā)現(xiàn)在基因組序列中較大部分為長(zhǎng)度>200 nt的lncRNAs[5]。研究表明，lncRNA具有調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的作用，是影響骨骼肌功能、疾病的關(guān)鍵因子[6]。目前對(duì)于lncRNA的研究主要集中在對(duì)生物體的調(diào)控作用或編碼小肽等方面[7-8]。此外，lncRNA還與肌肉發(fā)育相關(guān)，如在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)lncRNA MAR1可增加小鼠肌肉重量和強(qiáng)度，敲低后肌肉重量和強(qiáng)度降低[1]；干擾linc-RAM可抑制小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程，影響肌肉再生[9]；干擾lnc-mg可導(dǎo)致小鼠肌肉萎縮，過(guò)表達(dá)lnc-mg會(huì)造成小鼠肌肉肥大[10]。由于lncRNA作用機(jī)制復(fù)雜，方式多樣，在物種間保守性很低，使得不同種屬動(dòng)物lncRNA之間作用關(guān)系不大，且目前研究多集中于人和小鼠等生物體內(nèi)，而對(duì)牛肌肉生長(zhǎng)影響鮮有報(bào)道[11]。實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序共發(fā)現(xiàn)13條差異表達(dá)的lncRNAs，其中l(wèi)nc23對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具有調(diào)控作用[12]。鑒于此，本試驗(yàn)選擇其中一條差異高表達(dá)的lnc721進(jìn)行探究，深入分析lnc721干擾模型對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用，以期為研究lncRNA在牛肌肉中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 原代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)源于6月齡西門塔爾胎牛的腿臀肌、肩胛肌，均由天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并凍存。

1.1.2 主要試劑及儀器 siRNA和Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit均購(gòu)自廣州瑞博生物技術(shù)有限公司；Opti-MEM?Meduium、胎牛血清和馬血清均購(gòu)自Life Technologies公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；ECL試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶、RIPA Buffer和PMSF均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；All-in-OneTMqPCR Mix購(gòu)自GeneCopoeia公司；MyHC抗體購(gòu)自DSHB公司；MyoG抗體、GAPDH抗體和Goat Anti-mouse IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自三洋電機(jī)公司；倒置顯微鏡購(gòu)自Leica公司；Light Cycler?96熒光定量PCR儀購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell及電泳凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+均購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞復(fù)蘇后采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，將細(xì)胞傳至合適大小的孔板中，加入含10% FBS的DMEM增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞全部貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為50%～60%。收取增殖期細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分化期細(xì)胞需使用含2% HS培養(yǎng)基培養(yǎng)[12]。對(duì)增殖期及分化期第1、2、3天的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞提取RNA，利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA模板制備，反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min。―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 lnc721生物信息學(xué)分析與亞細(xì)胞定位 根據(jù)牛全基因組序列比對(duì)，在NCBI中查詢lnc721序列信息及上、下游基因，初步搜索潛在的靶基因；使用CPC網(wǎng)站預(yù)測(cè)lnc721編碼能力。牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化48 h后，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit進(jìn)行核質(zhì)分離試驗(yàn)，確定亞細(xì)胞定位。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)lnc721進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[13]，以GAPDH和Pre-GAPDH分別作為細(xì)胞質(zhì)(cyt)和細(xì)胞核(nuc)的標(biāo)志基因，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2―ΔΔCt方法計(jì)算。

1.2.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染 3個(gè)lnc721 siRNAs干擾序列均由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成：ASO-bta-lnc721_001(si-1)：5′-TTTCAAGCAGCCAGACAAAG-3′；ASO-bta-lnc721_002(si-2)：5′-AGGATGTCGCT-GTCTGTATA-3′；ASO-bta-lnc721_003(si-3)：5′-GGATCACAG-CCTGCCAACAC-3′。將牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)至可轉(zhuǎn)染狀態(tài)，分別將合成的3個(gè)干擾序列及對(duì)照(NC)轉(zhuǎn)染進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞中，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取增殖期細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。以GAPDH為內(nèi)參基因檢測(cè)干擾效果，選用效果最佳的siRNA進(jìn)行下一步試驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.2。

1.2.4 EdU檢測(cè) 將細(xì)胞接種至96孔板中，設(shè)置試驗(yàn)組和對(duì)照組，各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)操作按照Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，每孔拍照并計(jì)數(shù)，推算出EdU標(biāo)記指數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志因子mRNA表達(dá)量 將牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代至24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h換液處理，24 h后收取增殖期RNA，分化期細(xì)胞需更換成分化培養(yǎng)基，并定期觀察細(xì)胞分化狀態(tài)。于分化第3天收取細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志因子(Ki-67和Pax7)及分化標(biāo)志因子(MyHC和MyoG)的mRNA表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.2。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志因子蛋白水平表達(dá)量 采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，采用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白質(zhì)量。SDS-PAGE參數(shù)：80 V 30 min，120 V 45 min；轉(zhuǎn)膜條件：300 mA 2 h。采用Western blotting檢測(cè)Pax7、Ki-67、MyHC、MyoG及內(nèi)參蛋白水平表達(dá)量，先將待測(cè)條帶裝入含有一抗的雜交袋中，4 ℃過(guò)夜孵育，取出后清洗5次，每次5 min，隨后孵育對(duì)應(yīng)二抗1 h，再次清洗5次，每次5 min，使用ECL發(fā)光液上機(jī)曝光[14-16]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，EdU染色結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 lnc721在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后的表達(dá)量

收集增殖期、分化期第1、2、3天的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)lnc721的時(shí)間序列表達(dá)量情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著時(shí)間的推進(jìn)，lnc721的表達(dá)量逐漸升高，在分化期第2天，lnc721在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)量開(kāi)始極顯著升高(P<0.01)；在分化期第3天，表達(dá)量相較增殖期升高約4倍(P<0.01)。

①GM,牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期；DM1、DM2、DM3,牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化1、2、3 d。②與GM期相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)

2.2 lnc721生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位

通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)，lnc721位于18號(hào)染色體上，為未報(bào)道的lncRNA。CPC網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lnc721編碼潛能為―1.33129(圖2)。核質(zhì)分離試驗(yàn)表明，lnc721在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖3)。

圖2 CPC網(wǎng)站lnc721蛋白編碼能力預(yù)測(cè)

圖3 lnc721亞細(xì)胞定位檢測(cè)

2.3 干擾lnc721表達(dá)對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

將lnc721的siRNAs(si-1、si-2、si-3)轉(zhuǎn)染進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，收取增殖期細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾lnc721在增殖期的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，與對(duì)照組相比，si-1、si-2、si-3均極顯著降低了lnc721的表達(dá)(P<0.01)，其中si-1效果最明顯。

與對(duì)照組(NC)相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns,差異不顯著(P>0.05)。下同

將lnc721的si-1轉(zhuǎn)染進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，分別提取增殖期和分化期RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，si-1在細(xì)胞增殖期和分化期均極顯著或顯著下調(diào)了lnc721表達(dá)量(P<0.01；P<0.05)。進(jìn)一步采用EdU染色試驗(yàn)檢測(cè)增殖期細(xì)胞數(shù)量變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯增多，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting方法檢測(cè)干擾lnc721對(duì)增殖標(biāo)志因子Ki-67和Pax7基因在mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7、8。由圖7、8可知，干擾lnc721后，Ki-67和Pax7基因mRNA表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)；Ki-67蛋白表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)，Pax7蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。表明干擾lnc721可促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。

圖5 siRNA對(duì)lnc721表達(dá)量的影響

A,EdU染色圖；B,EdU陽(yáng)性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)圖

圖7 細(xì)胞增殖標(biāo)志因子mRNA表達(dá)水平

A，Western blotting曝光圖；B，Western blotting量化結(jié)果。圖10同

2.4 干擾lnc721表達(dá)對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化影響

將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，檢測(cè)干擾lnc721后對(duì)分化標(biāo)志因子MyHC和MyoG在mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干擾lnc721后MyHC和MyoG基因表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01，圖9)；MyoG蛋白表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)，但MyHC蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖10)。提示干擾lnc721可以顯著抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化進(jìn)程。

圖9 細(xì)胞分化標(biāo)志因子mRNA表達(dá)水平

圖10 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞分化標(biāo)志因子蛋白表達(dá)水平

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNAs參與調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，是影響骨骼肌功能的關(guān)鍵因子，而這些lncRNAs常常在骨骼肌細(xì)胞分化期內(nèi)展示出時(shí)序上升表達(dá)趨勢(shì)，如linc-MD1[17]、lncMyoD[18]、lncRNA-133a[19]等。本研究通過(guò)時(shí)序表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌細(xì)胞分化第3天，lnc721表達(dá)量與增殖期相比高達(dá)4倍以上，故選取分化期第3天的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)干擾試驗(yàn)，且經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分化期第3天的lnc721干擾模型對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化具有顯著的抑制作用。

亞細(xì)胞定位是決定lncRNA功能的關(guān)鍵，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中l(wèi)ncRNA發(fā)揮的功能大不相同。相較于細(xì)胞核定位的lncRNA,位于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA可影響mRNA的穩(wěn)定性[20-21]。另外，細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA通常吸附miRNA形成ceRNA以調(diào)節(jié)它們的活性和水平，影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾等功能[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，lnc721在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有分布，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。Zhai等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大部分的linc-RAM存在于肌肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，可通過(guò)調(diào)節(jié)PYGM活性促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化；Tan等[26]研究報(bào)道，定位于細(xì)胞質(zhì)的lncRNAG1430可作為ceRNA海綿吸附ssc_miR-133a-3p，從而促進(jìn)豬的成肌細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞增殖。本研究中的lnc721與以上研究的lncRNA亞細(xì)胞定位相同，推測(cè)lnc721可能發(fā)揮了某種細(xì)胞質(zhì)lncRNA功能，參與了對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的正調(diào)控及對(duì)其分化的負(fù)調(diào)控。

研究表明，設(shè)計(jì)過(guò)表達(dá)及干擾模型可檢測(cè)lncRNA在細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)量水平[27]，而通過(guò)不同時(shí)期標(biāo)志因子的表達(dá)量檢測(cè)可以間接反映出目的基因?qū)ε９趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞的調(diào)控情況。如Ki-67、Pax7基因在細(xì)胞增殖期大量表達(dá)，可將其作為細(xì)胞增殖期標(biāo)志因子[28-29]。本研究中，干擾lnc721后發(fā)現(xiàn)，Ki-67、Pax7基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄組水平上均顯著上調(diào)，這與Chen等[12]發(fā)現(xiàn)的在干擾lnc23后可正調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用相一致；而在細(xì)胞周期退出、分化開(kāi)始時(shí)期，MRFs家族基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中MyoG基因參與調(diào)控肌細(xì)胞融合；MyHC基因作為骨骼肌內(nèi)粗肌絲的主要成分，在細(xì)胞分化后期大量表達(dá)[30-31]。本研究在干擾lnc721后，MyHC和MyoG基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄組水平上均極顯著降低；在蛋白水平上MyHC表達(dá)量極顯著下調(diào)，即在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化期呈現(xiàn)出的負(fù)調(diào)控作用，與Chen等[12]研究的干擾lnc23可抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的調(diào)控作用相一致，但與張俊星等[32]研究的干擾lncRNA135494可正調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化作用相反，推測(cè)其原因是由于不同基因具有不同的調(diào)控表達(dá)所致。此外，在對(duì)增殖標(biāo)志因子Ki-67和分化標(biāo)志因子MyoG的蛋白水平檢測(cè)時(shí)均出現(xiàn)了表達(dá)量變化不顯著的情況，其原因可能與這些標(biāo)志因子自身表達(dá)特性的影響相關(guān)，在基因翻譯階段受其他因素影響所致，但根據(jù)Pax7及MyHC蛋白水平的表達(dá)量結(jié)果可以看出，干擾lnc721具有促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖并抑制其分化的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中l(wèi)nc721進(jìn)行干擾發(fā)現(xiàn)，干擾lnc721表達(dá)可以促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并抑制其成肌分化過(guò)程，驗(yàn)證了干擾lnc721表達(dá)在調(diào)控肌肉發(fā)育分化中的生物功能。