龔文滔，潘向春，蔡佳麗，王祎菲，李加琪，張 哲，袁曉龍

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

表觀遺傳學(xué)是指基因活性或功能的可遺傳變化現(xiàn)象，與DNA序列本身的變化無(wú)關(guān)。作為研究最廣泛的表觀遺傳機(jī)制之一，DNA甲基化是一種不改變DNA序列順序的堿基修飾[1]，且廣泛參與哺乳動(dòng)物多種生物學(xué)進(jìn)程，包括轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)[2-3]、X染色體失活[2]、基因組印跡[2,4]和染色體穩(wěn)定性[4]。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)的胞嘧啶上，并在細(xì)胞分裂過(guò)程中被穩(wěn)定遺傳[5]，而DNA甲基化的發(fā)生離不開甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用。DNMT可將甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5個(gè)碳原子上，從而形成甲基化胞嘧啶[6]。目前哺乳動(dòng)物中主要發(fā)現(xiàn)4種類型的DNMT，分別為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L[7]。DNMT1主要用于維持基因組的DNA甲基化狀態(tài)；DNMT3A和DNMT3B具有從頭甲基化的功能，即對(duì)非甲基化的DNA進(jìn)行甲基化修飾；DNMT3L可增強(qiáng)DNMT3A和DNMT3B的催化活性，促進(jìn)DNA的從頭甲基化過(guò)程[8-9]。

DNMT參與哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病等多種生物學(xué)活動(dòng)。有研究表明，敲除DNMT1或DNMT3B后，小鼠在妊娠期中死亡，而敲除DNMT3A后，小鼠在出生后4周齡死亡[10]。Liao等[11]使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除人類胚胎干細(xì)胞中的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT1的缺失導(dǎo)致人類胚胎干細(xì)胞的快速死亡。此外，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的過(guò)表達(dá)會(huì)降低抑癌基因的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，如結(jié)腸癌、肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、前列腺癌和乳腺癌[12]。Rhee等[13]表明，同時(shí)抑制DNMT1和DNMT3B的表達(dá)可使結(jié)直腸癌模型中的抑癌基因整體低甲基化并被重新激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖減少。以上結(jié)果表明，DNMT廣泛參與哺乳動(dòng)物生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)控過(guò)程。

目前，關(guān)于豬DNMT基因家族的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。本研究以豬為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)方法鑒定豬全基因組范圍的DNMT基因家族，并對(duì)豬DNMT基因家族成員進(jìn)行染色體定位、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化和種間共線性分析，探討DNMT基因家族在母豬性腺軸初情啟動(dòng)過(guò)程前、中、后的基因表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步探究豬DNMT基因家族功能與調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬DNMT基因家族的鑒定和染色體定位分析

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)中下載豬的全基因組序列文件、基因注釋文件、蛋白質(zhì)序列文件。從Pfam網(wǎng)站(https:∥pfam.xfam.org/)下載DNMT家族的隱馬爾科夫模型(HMM)文件(PF00145)，利用Hammer軟件中的hmmsearch程序搜索豬蛋白質(zhì)序列文件，進(jìn)而鑒定DNMT基因家族成員?；贖ammer軟件的鑒定結(jié)果，利用BLASTP程序進(jìn)行第2次DNMT基因家族鑒定。將Hammer軟件和BLASTP程序的鑒定結(jié)果合并，得到候選DNMT基因家族成員。通過(guò)CDD網(wǎng)站(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwr psb/bwrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，剔除候選DNMT基因家族成員中不含DNMT特征結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到豬DNMT家族成員。從基因注釋文件中獲得豬DNMT基因的位置信息，并通過(guò)TBtools[14]繪制豬DNMT基因的染色體定位圖。

1.2 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基于基因注釋文件，使用TBtools展示DNMT基因家族成員的UTR及內(nèi)含子信息。通過(guò)MEME網(wǎng)站(https:∥meme-suite.org/meme/tools/meme)對(duì)DNMT基因家族成員進(jìn)行保守基序(motif)分析，其中motif數(shù)量設(shè)置為10個(gè)，其余參數(shù)選擇默認(rèn)，最后通過(guò)TBtools得到可視化圖形。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹和種間共線性分析

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人、小鼠和牛的全基因組序列文件、基因注釋文件、蛋白質(zhì)序列文件，然后使用Hammer軟件和BLASTP軟件初步鑒定人、小鼠和牛的DNMT基因家族成員，再通過(guò)CDD網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，以獲得人、小鼠和牛的DNMT基因家族成員。使用Mega 10.1.7軟件對(duì)豬、人、小鼠和牛的DNMT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，并基于距離參數(shù)的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)自展值為1 000，其他參數(shù)則按默認(rèn)設(shè)置?；谪i、人、小鼠和牛的基因序列文件和基因注釋文件，使用TBtools的One Step MCScanX功能進(jìn)行物種間的共線性分析，并使用TBtools的Dual Systeny Plot for MCScanX功能進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析

利用ExPASy在線工具(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分析豬DNMT基因家族成員的蛋白質(zhì)特性，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；利用SOPMA在線工具(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)DNMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用PSORT在線工具(https:∥wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行DNMT蛋白的亞細(xì)胞定位分析。

1.5 豬DNMT基因家族成員的表達(dá)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取母豬下丘腦、垂體、卵巢的RNA-Seq數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：PRJEB39729)[15]，其中每種組織都包含初情啟動(dòng)前、初情啟動(dòng)、初情啟動(dòng)后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共下載27個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后，利用HISAT2軟件[16]將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，隨后利用Stringtie軟件[17]估計(jì)基因的表達(dá)量，以基因最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量作為該基因的表達(dá)水平，從而獲得DNMT基因家族所有成員的表達(dá)水平。根據(jù)DNMT基因表達(dá)量的TPM值，利用R語(yǔ)言繪制出基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 豬DNMT基因家族鑒定和染色體定位分析

利用Hmmer軟件和BLASTP軟件從豬基因組上共鑒定出5個(gè)DNMT基因家族成員，并將其命名為PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5，其長(zhǎng)度介于13 726～80 213 bp，其中3個(gè)基因位于參考基因組的正鏈，2個(gè)基因位于參考基因組的負(fù)鏈(表1)。由圖1可知，PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因分別位于2、3、13、14、17號(hào)染色體上，每條染色體都只包含1個(gè)DNMT基因。

2.2 豬DNMT基因序列結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)MEME在線工具進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果如圖2所示，PigDNMT1和PigDNMT2僅包含1個(gè)motif，PigDNMT3包含6個(gè)motif，而PigDNMT2和PigDNMT5包含10個(gè)相同的motif且排列順序一致。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，大部分DNMT基因含有多個(gè)CDS區(qū)域，僅PigDNMT4含有2個(gè)CDS區(qū)域；此外，還發(fā)現(xiàn)PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT5缺少3′-UTR(圖2)。從豬DNMT基因家族進(jìn)化樹的角度分析發(fā)現(xiàn)，PigDNMT1和PigDNMT4、PigDNMT2和PigDNMT5的親緣關(guān)系較近(圖2)。整體而言，同一分支上的DNMT基因在motif數(shù)量上相似，但在基因結(jié)構(gòu)上差異較大。

圖2 豬DNMT基因家族結(jié)構(gòu)特征

2.3 DNMT基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究使用Hammer和BLASTP軟件在人、小鼠、牛中分別鑒定出6、7、5個(gè)DNMT基因(表2)，并結(jié)合5個(gè)豬DNMT基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，23個(gè)DNMT基因可分成Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ 3個(gè)亞族，其中Class Ⅰ亞族可被進(jìn)一步細(xì)分為Class Ⅰ-a和Class Ⅰ-b亞族。在4個(gè)亞族中，Class Ⅰ-a亞族的DNMT基因數(shù)量最多，共有14個(gè)DNMT基因，其中包含PigDNMT1、PigDNMT3和PigDNMT4；Class Ⅰ-b共有5個(gè)DNMT基因，其中包含PigDNMT5；Class Ⅱ亞族共有3個(gè)DNMT基因，其中包含PigDNMT2；而Class Ⅲ亞族的DNMT基因數(shù)量最少，僅包含CattleDNMT5。此外，根據(jù)豬與人、小鼠、牛的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，豬與牛的DNMT基因家族親緣關(guān)系更近。

表2 人、小鼠和牛DNMT基因家族成員基本信息

圖3 豬、人、小鼠和牛DNMT基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 DNMT基因的共線性分析

為了進(jìn)一步了解豬DNMT基因家族的進(jìn)化關(guān)系，使用TBtools的One Step MCScanX功能對(duì)豬、人、小鼠和牛中DNMT基因家族進(jìn)行物種間的共線性分析。如圖4所示，豬和人、小鼠、牛之間具有4對(duì)直系同源DNMT基因，其中PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4都能在人、小鼠和牛中鑒定到相應(yīng)的直系同源基因，只有PigDNMT5無(wú)法在其他3個(gè)物種中檢測(cè)出直系同源基因。

圖4 豬、人、小鼠和牛DNMT基因家族的共線性分析

2.5 豬DNMT蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

豬DNMT基因家族成員的蛋白長(zhǎng)度在228(PigDNMT4)～1 706 個(gè)氨基酸(PigDNMT1)之間；分子質(zhì)量介于26 133.32(PigDNMT4)～192 267.80 u(PigDNMT1)之間；而蛋白等電點(diǎn)最小為6.00(PigDNMT3)，最大為9.06(PigDNMT4)，其中2個(gè)DNMT蛋白呈酸性(等電點(diǎn)<7)，3個(gè)DNMT蛋白呈堿性(等電點(diǎn)>7)(表3)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，豬DNMT基因家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲組成，隨后依次為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，豬DNMT基因家族蛋白全部定位于細(xì)胞核中(表4)。

表3 豬DNMT蛋白的理化性質(zhì)

表4 豬DNMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位

2.6 不同發(fā)育時(shí)期豬DNMT基因家族的表達(dá)變化

對(duì)豬性腺軸初情啟動(dòng)前、初情啟動(dòng)、初情啟動(dòng)后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5基因在性腺軸初情啟動(dòng)過(guò)程中都處于低表達(dá)狀態(tài)，而PigDNMT1表達(dá)量明顯高于其他4個(gè)基因，且在初情啟動(dòng)過(guò)程的不同組織中發(fā)生不同的變化。在初情啟動(dòng)過(guò)程的下丘腦組織中，PigDNMT1基因表達(dá)量先升高后降低；在初情啟動(dòng)過(guò)程的垂體組織中，PigDNMT1基因表達(dá)量逐漸升高；在初情啟動(dòng)過(guò)程的卵巢組織中，PigDNMT1基因表達(dá)量逐漸下降。

H，下丘腦；P，垂體；O，卵巢；Pre，初情期啟動(dòng)前；In，初情期啟動(dòng)中；Post，初情期啟動(dòng)后

3 討 論

在豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，DNMT可能通過(guò)影響DNA甲基化狀態(tài)和形成過(guò)程而參與多種生物學(xué)機(jī)制，但是在豬中對(duì)于DNMT基因家族的系統(tǒng)分析還不全面。本研究利用生物信息學(xué)方法在豬基因組上共鑒定出5個(gè)DNMT基因，基因數(shù)目低于人(6個(gè))和小鼠(7個(gè))，而與牛(5個(gè))一致，這可能與基因組的大小及基因的丟失和保留事件有關(guān)[18]。豬DNMT基因家族進(jìn)化樹和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，PigDNMT2和PigDNMT5的親緣關(guān)系較近，且具有相同數(shù)量和排列順序的motif，說(shuō)明這2個(gè)基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高保守性，推測(cè)PigDNMT2和PigDNMT5可能具有相似的基因功能。從基因結(jié)構(gòu)的整體而言，豬DNMT基因家族成員之間的基因結(jié)構(gòu)差異較大，如基因長(zhǎng)度(13 726～80 213 bp)和CDS區(qū)長(zhǎng)度(1 137～5 081 bp)，這與雞NLRs基因家族和杜蘭落花生球蛋白基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致[19-20]。另有研究表明，各成員間基因結(jié)構(gòu)的差異可能與基因進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)重復(fù)、插入和缺失等突變現(xiàn)象有關(guān)[21]。基因共線性分析發(fā)現(xiàn)，豬和人、小鼠、牛之間都具有4對(duì)直系同源DNMT基因，說(shuō)明4個(gè)物種之間具有較強(qiáng)的共線性關(guān)系，而從4個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果中可以看出，豬與牛的DNMT基因家族親緣關(guān)系更近。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，5個(gè)豬DNMT蛋白處于細(xì)胞核中。彭忠明等[22]也在毛竹中發(fā)現(xiàn)7個(gè)DNMT蛋白定位于細(xì)胞核中，這些結(jié)果表明DNMT可能是在細(xì)胞核內(nèi)參與生物學(xué)進(jìn)程。

基因表達(dá)模式與其生物學(xué)功能高度相關(guān)。本研究揭示了母豬性腺軸組織中DNMT基因家族在初情啟動(dòng)前、初情啟動(dòng)、初情啟動(dòng)后中的表達(dá)模式，結(jié)果表明PigDNMT1表達(dá)量在下丘腦、垂體和卵巢組織中隨著初情啟動(dòng)過(guò)程而發(fā)生不同的變化，如垂體組織中的PigDNMT1表達(dá)量在初情啟動(dòng)過(guò)程中逐漸上升，而卵巢組織中的PigDNMT1表達(dá)量在初情啟動(dòng)過(guò)程中逐漸下降。性腺軸可通過(guò)調(diào)節(jié)激素分泌驅(qū)動(dòng)雌性動(dòng)物的初情啟動(dòng)[23-24]，進(jìn)一步說(shuō)明PigDNMT1可能在母豬初情啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這與前人關(guān)于DNMT基因可能通過(guò)調(diào)控促性腺激素釋放激素(GnRH)的表達(dá)而參與母羊初情啟動(dòng)的調(diào)控相符合[25]。另外有研究表明，DNA甲基化參與哺乳動(dòng)物初情啟動(dòng)的調(diào)控過(guò)程[26-27]。Lomniczi等[26]給大鼠注射DNA甲基化抑制劑之后，大鼠下丘腦中的胚胎外胚層發(fā)育(Eed)基因和染色盒同源物7(Cbx7)基因的表達(dá)水平上升，啟動(dòng)子的甲基化水平下降，并且大鼠的陰道開放延遲，未達(dá)到初情期，表明DNA甲基化在大腦的神經(jīng)內(nèi)分泌中起作用，通過(guò)抑制初情期啟動(dòng)所需的基因(如吻素1(Kiss1)基因)控制青春期。Zhou等[27]研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可通過(guò)調(diào)節(jié)R-脊椎蛋白2(RSPO2)的表達(dá)水平影響卵泡發(fā)育進(jìn)而影響母豬的初情啟動(dòng)。綜合以上結(jié)果及DNMT在DNA甲基化狀態(tài)和形成過(guò)程中的作用，說(shuō)明豬DNMT基因家族中的PigDNMT1可能通過(guò)影響性腺軸關(guān)鍵基因的DNA甲基化參與母豬初情啟動(dòng)的調(diào)控過(guò)程，這對(duì)于母豬初情啟動(dòng)調(diào)控機(jī)制研究具有重要的參考價(jià)值，但PigDNMT1在母豬初情啟動(dòng)過(guò)程中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究和分析。

4 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)方法在豬基因組上共鑒定出5個(gè)DNMT基因，并發(fā)現(xiàn)PigDNMT2和PigDNMT5在進(jìn)化過(guò)程中具有較高保守性。共線性和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，豬、人、小鼠和牛的DNMT基因間存在較強(qiáng)的共線性關(guān)系，但豬與牛的DNMT基因家族親緣關(guān)系更近。此外，性腺軸組織中的PigDNMT1在初情啟動(dòng)過(guò)程中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。本研究可為深入解析豬DNMT基因家族功能提供一些參考。