李落葉 楊曉朱 雷夢英 梁傳冠 何旭君 黃少彬

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院/植物有害生物防控與生物環(huán)境健康應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510520；2.惠州泰合新創(chuàng)科技有限公司，廣東 惠州 516000）

薯莨Dioscorea cirrhosa是薯蕷科多年生藤本植物，生于山坡、路旁、林中，盛產(chǎn)于我國廣東、廣西、貴州、湖南、浙江等地。薯莨塊莖含有豐富的單寧，具有抑菌、止血功效，醫(yī)藥領(lǐng)域被用于治療內(nèi)傷吐血、外傷出血、胃炎、腸炎等癥[1]。在紡織印染領(lǐng)域，薯莨浸汁被廣泛用于染皮制革、染布等工藝，是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品——香云紗制作過程中的染色原料。

單寧是一類廣泛存在于植物界的酚類化合物，是高等植物體內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物，其具有豐富多樣的結(jié)構(gòu)類型和各種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，單寧類化合物對細(xì)菌、真菌、病毒等多種微生物都有很強(qiáng)的抑菌作用[2-5]。據(jù)報道，番石榴Psidium guajava葉片提取物（主要成分為單寧）對白菜軟腐病菌有抑制作用，能延緩白菜軟腐病的發(fā)生[6]。多種植物的單寧提取物對煙草花葉病毒（TMV）具有明顯的體外抑制作用[7]。薯莨塊莖中單寧含量非常高，為11%～38%之間[8]，因此，薯莨具備開發(fā)天然殺菌劑的潛力。

本試驗(yàn)以薯莨和薯莨渣為原料，比較了丙酮浸提和乙醇浸提兩種方法提取薯莨單寧的產(chǎn)物得率，并采用體外抑菌試驗(yàn)測定薯莨提取物對供試細(xì)菌和真菌菌株的抑菌活性，為進(jìn)一步研究開發(fā)薯莨植物源殺菌劑、充分利用薯莨資源、減少資源浪費(fèi)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 薯莨原料 來自惠州大嵐的野生薯莨塊莖，經(jīng)洗凈、晾干后，切成長寬約5 mm × 5 mm、厚度2 mm至5 mm的小塊，分成兩組，一組直接用40℃烘箱烘干備用。香云紗制作過程中，需要用到薯莨水對織物進(jìn)行浸染[9-10]，過水后剩下的薯莨渣被當(dāng)做廢棄物隨意堆放、焚燒處理，未得到有效利用。為了充分利用資源、減少浪費(fèi)，研究薯莨渣中生物活性成分單寧的含量情況，本研究模擬香云紗制作中薯莨渣的生成過程，將另一組薯莨先過兩次水，然后瀝干得薯莨渣，再用40℃烘箱烘干備用。

1.1.2 供試菌株 所用菌株都為本研究室從患病植物分離保存。真菌菌株3個：引起猴耳環(huán)Pithecellobium clypearia枝干病害的炭疽病菌（暫定名為H30，Colletotrichumsp.）、擬莖點(diǎn)霉（暫定名為H63，Phomopsissp.），引起猴耳環(huán)葉斑病的擬盤多毛孢屬真菌（暫定名為H69，Pestalotiopsissp.）；以及來自廣藿香Pogostemon cablin青枯病病株的細(xì)菌菌株1個（暫定名為GHB2，Ralstoniasp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)真菌、細(xì)菌均采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：200 g 馬鈴薯煮汁，加入20 g葡萄糖、20 g 瓊脂粉，蒸餾水定容到1 000 mL，滅菌，冷卻后，制成固體平板培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 薯莨單寧提取及含量測定 比較了丙酮浸提和乙醇浸提兩種方法。稱取備用的干薯莨或薯莨渣，用60%丙酮或75%乙醇按照料液比1 : 10在60 ℃下浸提3 h，過濾，濾液用Heidolph Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，蒸發(fā)條件為50 ℃、0.08 MP，獲得的浸膏在40 ℃下烘干成粉狀。

提取物得率計算：提取物得率 = （浸出物干粉質(zhì)量 ÷ 干薯莨質(zhì)量）× 100%

提取物中單寧含量測定：Follin酚法，具體參照林倩等的方法[11]。

1.2.2 藥劑的準(zhǔn)備 稱取適量丙酮浸提法獲得的薯莨提取物干粉，用50%甲醇溶解，分別配制成200、150、100、50、10、5 mg/mL溶液；陽性對照采用華諾生物科技有限公司生產(chǎn)的噁霉靈，用50%甲醇稀釋成濃度為3 mg/mL的溶液；陰性對照為50%甲醇溶液。

1.2.3 薯莨提取物對菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法。分別取150、100、50 mg/mL的薯莨提取物各0.2 mL，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基，以涂布3 mg/mL噁霉靈和50%甲醇0.2 mL作為對照。用滅菌的尖頭鑷子，在新鮮活化的病原菌菌落邊緣小心夾取極小量菌絲，接種到上述含有藥劑的平板培養(yǎng)基，26 ℃下暗培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3次，取平均值。

菌絲抑制率 = （對照組菌落直徑－試驗(yàn)組菌落直徑 ) ÷對照組菌落直徑 × 100% 。

1.2.4 細(xì)菌懸液的制備 保存的菌液先劃線活化培養(yǎng)，24 h后挑取單菌落用無菌水稀釋后涂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無菌水洗脫平板上的新鮮菌苔，并制成懸浮菌液，菌液濃度調(diào)整為OD600 = 0.1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5 薯莨提取物抑制細(xì)菌能力的測定 采用濾紙片法。用打孔器將濾紙制成直徑為 6 mm的圓紙片,高壓鍋滅菌內(nèi)121 ℃滅菌20 min后烘干，取0.1 mL新鮮菌液均勻涂布在PDA固體平板培養(yǎng)基上，用無菌鑷子夾取濾紙片平鋪于含菌平板上，每皿放4個濾紙片，使各紙片之間均勻間隔一定距離，在每個紙片上滴加5 μL藥劑，以滴加50%甲醇為陰性對照，設(shè)3次重復(fù)。28 ℃下暗培養(yǎng)24 h，十字交叉法測量各處理的抑菌圈直徑，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 薯莨提取物得率及單寧含量

按照1.2.1的方法，薯莨提取物得率及有效成分含量如表1。從表1可以看出，采用丙酮浸提法時，薯莨產(chǎn)物得率和產(chǎn)物中單寧含量都明顯高于乙醇提取法，因此，丙酮提取法更適合提取薯莨單寧。同樣的提取方法下，薯莨渣的提取物得率比薯莨提取物得率低約50%，其原因可能是由于過水后薯莨中部分單寧等物質(zhì)隨水流失，所以產(chǎn)物變少，但產(chǎn)物中單寧含量仍然很高，與薯莨提取物相近，說明薯莨渣提取物同樣具備抑菌潛力。

表1 不同條件下提取物得率及其單寧含量Tab.1 The output rate of extracts and tannic acid content in extracts under different extraction method

2.2 薯莨提取物對真菌的抑制作用

測試了薯莨丙酮提取物（下面以“T”表示）對炭疽病菌H30、擬莖點(diǎn)霉H63和擬盤多毛孢屬真菌H69的抑制活性。噁霉靈是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的真菌殺菌劑，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3 mg/mL噁霉靈為陽性對照。結(jié)果表明，T液對H30有明顯的抑制作用，但抑制程度低于噁霉靈（圖1. a, b, c）；對H63菌絲的生長也有明顯抑制，濃度在100 mg/mL時的抑制程度接近3 mg/mL噁霉靈（圖1. d, e,f），而對H69無抑制作用(圖1. g, h, i)。

圖1 薯莨提取物對來自猴耳環(huán)的炭疽病菌H30、擬莖點(diǎn)霉H63和擬盤多毛孢屬真菌H69的抑制活性Fig.1 The antimicrobial activity of the extracts from Dioscorea cirrhosa to a species of Colletotrichum H30, a species of Phomopsis H63 and a species of Pestalotiopsis H69 from Archidendron lucidum

不同濃度的T液對H30和H63均有抑制活性，抑制效果隨濃度增大而增強(qiáng)，100 mg/mL的T液對H30的菌絲抑制率達(dá)46.2%；對H63的菌絲抑制率也達(dá)到31.9%，接近3 mg/mL噁霉靈的抑制率，150 mg/mL 的T液對H63的菌絲抑制率略高于3 mg/mL噁霉靈；測試濃度下，T液沒有表現(xiàn)出對H69的抑制效果（表2）。

表2 薯莨提取物對猴耳環(huán)真菌病原菌絲生長的影響Tab.2 The effects of Dioscorea cirrhosa extracts on three pathogenic fungi of A. lucidum

2.3 薯莨提取物對細(xì)菌的抑制作用

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薯莨提取物對廣藿香青枯病菌株GHB2有顯著抑制效果，濃度越大抑菌效果越好，濃度達(dá)到50 mg/mL時，抑菌圈直徑14.3 mm，抑菌效果明顯（圖2a），低濃度下抑菌效果較弱，濃度為10 mg/mL時，抑菌圈直徑10 mm（圖2b）；5 mg/mL時，抑菌能力極微弱，但與空白對照相比，仍然能觀察到很小的抑菌圈（圖2c，表3）。

表3 不同濃度薯莨提取物對廣藿香青枯病菌GHB2的抑菌活性Tab.3 The antibacterial activity of different concentrations of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of P. cablin

圖2薯莨提取物對廣藿香青枯病菌GHB2的抑菌效果Fig.2 The antibacterial activity of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of Pogostemon cablin

3 結(jié)論與討論

提取植物活性成分的方法很多，不同植物原料、不同溶劑，不同料液比、不同浸提溫度和浸提時間等都會對提取物的得率和成分造成影響[12-14]。利用乙醇和丙酮浸提是兩種常用方法，有研究表明丙酮為溶劑提取薯莨單寧時，濃度以60%為好[10]，以乙醇為溶劑時，濃度在80%左右為佳[11]。本研究比較了60%丙酮和75%乙醇對薯莨單寧的提取效率及提取物中單寧含量的差異，發(fā)現(xiàn)不管是薯莨還是薯莨渣，以60%丙酮浸提獲得的產(chǎn)物得率更高、產(chǎn)物單寧含量也更高。因此，在本研究采用的提取方法中（見1.2.1），用丙酮浸提薯莨單寧比用乙醇浸提更合適。近期有報道用“乙醇+甘油”和“甲醇+甘油”等復(fù)合溶液為溶劑提取植物單寧，大大提高了產(chǎn)物得率[15]，未來可考慮利用類似的辦法進(jìn)一步改進(jìn)提取方法，提高產(chǎn)物得率。

猴耳環(huán)和廣藿香都是重要中藥材，種植過程中病害較多，對藥材產(chǎn)量和質(zhì)量影響大，藥材的用途決定了其病害的防治要更加注重綠色、無公害，開發(fā)植物源殺菌劑防治中藥植物病害具有良好的應(yīng)用前景。本研究選擇了分離自猴耳環(huán)病株的3種真菌：炭疽病菌、擬莖點(diǎn)霉、擬盤多毛孢菌，這些病菌能引起多種植物病害，具有代表性。測試了薯莨提取物對其抑制活性，結(jié)果顯示，薯莨提取物對炭疽病菌和擬莖點(diǎn)霉的菌絲生長有良好的抑制效果，說明薯莨提取物的確具備開發(fā)植物源殺菌劑的潛力，也可以考慮與其它藥劑進(jìn)行混配，形成互補(bǔ)，拓寬殺菌譜。研究也發(fā)現(xiàn)薯莨提取物對擬盤多毛孢真菌無作用，甚至在較低濃度下對擬盤多毛孢菌絲有輕微促生作用，說明其對真菌生長的抑制具有選擇性。對廣藿香青枯病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50 mg/mL的薯莨提取物對該菌具有良好抑制效果。導(dǎo)致植物青枯病的菌群復(fù)雜、變異多[16]，要將薯莨提取物開發(fā)成防治青枯病的藥劑，還需要測定其在植株上的實(shí)際防治效果。無論如何，薯莨提取物至少能夠抑制部分青枯病菌株的生長繁殖速度，可考慮制成無毒副作用的病害防治輔助劑，減輕病情，降低損失。

我國薯莨資源十分豐富，自然分布范圍廣，主要分布于南方中低海拔山區(qū)，廣東和廣西為薯莨的最高適生區(qū)，是當(dāng)前最密集的分布區(qū)域，在未來氣候變化的影響下，薯莨有進(jìn)一步向最高適生區(qū)即廣東、廣西兩省集中的趨勢[17]。目前，薯莨最多用于香云紗的制作工藝中,每到秋冬季節(jié)，數(shù)萬噸的薯莨廢渣經(jīng)風(fēng)干后直接被焚燒處理[18]，資源浪費(fèi)和環(huán)境污染較大。為充分利用本地薯莨資源，減少浪費(fèi)，減輕環(huán)境污染，本研究試圖從農(nóng)藥開發(fā)的角度探索薯莨利用的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，泡過水的薯莨渣中仍然含有大量單寧，提取物的得率是薯莨塊莖提取物得率的50%左右，提取物中單寧含量與薯莨提取物相仿，因此，薯莨渣提取物與薯莨提取物一樣具備開發(fā)成植物源農(nóng)藥的潛力。未來可從提高提取效率、降低提取成本方面進(jìn)一步研究薯莨單寧的大規(guī)模提取工藝，為實(shí)現(xiàn)薯莨資源的規(guī)?；玫於ɑA(chǔ)。

本研究明確了薯莨提取物對多種重要植物病原菌具有良好的直接抑菌效果，薯莨渣中亦提取到有效成分含量相同的提取物，對充分利用薯莨資源研發(fā)新型植物源殺菌劑、減少薯莨資源浪費(fèi)具有參考價值。