李落葉 楊曉朱 雷夢(mèng)英 梁傳冠 何旭君 黃少彬

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院/植物有害生物防控與生物環(huán)境健康應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510520；2.惠州泰合新創(chuàng)科技有限公司，廣東 惠州 516000）

薯莨Dioscorea cirrhosa是薯蕷科多年生藤本植物，生于山坡、路旁、林中，盛產(chǎn)于我國廣東、廣西、貴州、湖南、浙江等地。薯莨塊莖含有豐富的單寧，具有抑菌、止血功效，醫(yī)藥領(lǐng)域被用于治療內(nèi)傷吐血、外傷出血、胃炎、腸炎等癥[1]。在紡織印染領(lǐng)域，薯莨浸汁被廣泛用于染皮制革、染布等工藝，是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品——香云紗制作過程中的染色原料。

單寧是一類廣泛存在于植物界的酚類化合物，是高等植物體內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其具有豐富多樣的結(jié)構(gòu)類型和各種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，單寧類化合物對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等多種微生物都有很強(qiáng)的抑菌作用[2-5]。據(jù)報(bào)道，番石榴Psidium guajava葉片提取物（主要成分為單寧）對(duì)白菜軟腐病菌有抑制作用，能延緩白菜軟腐病的發(fā)生[6]。多種植物的單寧提取物對(duì)煙草花葉病毒（TMV）具有明顯的體外抑制作用[7]。薯莨塊莖中單寧含量非常高，為11%～38%之間[8]，因此，薯莨具備開發(fā)天然殺菌劑的潛力。

本試驗(yàn)以薯莨和薯莨渣為原料，比較了丙酮浸提和乙醇浸提兩種方法提取薯莨單寧的產(chǎn)物得率，并采用體外抑菌試驗(yàn)測(cè)定薯莨提取物對(duì)供試細(xì)菌和真菌菌株的抑菌活性，為進(jìn)一步研究開發(fā)薯莨植物源殺菌劑、充分利用薯莨資源、減少資源浪費(fèi)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 薯莨原料 來自惠州大嵐的野生薯莨塊莖，經(jīng)洗凈、晾干后，切成長寬約5 mm × 5 mm、厚度2 mm至5 mm的小塊，分成兩組，一組直接用40℃烘箱烘干備用。香云紗制作過程中，需要用到薯莨水對(duì)織物進(jìn)行浸染[9-10]，過水后剩下的薯莨渣被當(dāng)做廢棄物隨意堆放、焚燒處理，未得到有效利用。為了充分利用資源、減少浪費(fèi)，研究薯莨渣中生物活性成分單寧的含量情況，本研究模擬香云紗制作中薯莨渣的生成過程，將另一組薯莨先過兩次水，然后瀝干得薯莨渣，再用40℃烘箱烘干備用。

1.1.2 供試菌株 所用菌株都為本研究室從患病植物分離保存。真菌菌株3個(gè)：引起猴耳環(huán)Pithecellobium clypearia枝干病害的炭疽病菌（暫定名為H30，Colletotrichumsp.）、擬莖點(diǎn)霉（暫定名為H63，Phomopsissp.），引起猴耳環(huán)葉斑病的擬盤多毛孢屬真菌（暫定名為H69，Pestalotiopsissp.）；以及來自廣藿香Pogostemon cablin青枯病病株的細(xì)菌菌株1個(gè)（暫定名為GHB2，Ralstoniasp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)真菌、細(xì)菌均采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：200 g 馬鈴薯煮汁，加入20 g葡萄糖、20 g 瓊脂粉，蒸餾水定容到1 000 mL，滅菌，冷卻后，制成固體平板培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 薯莨單寧提取及含量測(cè)定 比較了丙酮浸提和乙醇浸提兩種方法。稱取備用的干薯莨或薯莨渣，用60%丙酮或75%乙醇按照料液比1 : 10在60 ℃下浸提3 h，過濾，濾液用Heidolph Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，蒸發(fā)條件為50 ℃、0.08 MP，獲得的浸膏在40 ℃下烘干成粉狀。

提取物得率計(jì)算：提取物得率 = （浸出物干粉質(zhì)量 ÷ 干薯莨質(zhì)量）× 100%

提取物中單寧含量測(cè)定：Follin酚法，具體參照林倩等的方法[11]。

1.2.2 藥劑的準(zhǔn)備 稱取適量丙酮浸提法獲得的薯莨提取物干粉，用50%甲醇溶解，分別配制成200、150、100、50、10、5 mg/mL溶液；陽性對(duì)照采用華諾生物科技有限公司生產(chǎn)的噁霉靈，用50%甲醇稀釋成濃度為3 mg/mL的溶液；陰性對(duì)照為50%甲醇溶液。

1.2.3 薯莨提取物對(duì)菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法。分別取150、100、50 mg/mL的薯莨提取物各0.2 mL，均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基，以涂布3 mg/mL噁霉靈和50%甲醇0.2 mL作為對(duì)照。用滅菌的尖頭鑷子，在新鮮活化的病原菌菌落邊緣小心夾取極小量菌絲，接種到上述含有藥劑的平板培養(yǎng)基，26 ℃下暗培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

菌絲抑制率 = （對(duì)照組菌落直徑－試驗(yàn)組菌落直徑 ) ÷對(duì)照組菌落直徑 × 100% 。

1.2.4 細(xì)菌懸液的制備 保存的菌液先劃線活化培養(yǎng)，24 h后挑取單菌落用無菌水稀釋后涂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無菌水洗脫平板上的新鮮菌苔，并制成懸浮菌液，菌液濃度調(diào)整為OD600 = 0.1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5 薯莨提取物抑制細(xì)菌能力的測(cè)定 采用濾紙片法。用打孔器將濾紙制成直徑為 6 mm的圓紙片,高壓鍋滅菌內(nèi)121 ℃滅菌20 min后烘干，取0.1 mL新鮮菌液均勻涂布在PDA固體平板培養(yǎng)基上，用無菌鑷子夾取濾紙片平鋪于含菌平板上，每皿放4個(gè)濾紙片，使各紙片之間均勻間隔一定距離，在每個(gè)紙片上滴加5 μL藥劑，以滴加50%甲醇為陰性對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)。28 ℃下暗培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)量各處理的抑菌圈直徑，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 薯莨提取物得率及單寧含量

按照1.2.1的方法，薯莨提取物得率及有效成分含量如表1。從表1可以看出，采用丙酮浸提法時(shí)，薯莨產(chǎn)物得率和產(chǎn)物中單寧含量都明顯高于乙醇提取法，因此，丙酮提取法更適合提取薯莨單寧。同樣的提取方法下，薯莨渣的提取物得率比薯莨提取物得率低約50%，其原因可能是由于過水后薯莨中部分單寧等物質(zhì)隨水流失，所以產(chǎn)物變少，但產(chǎn)物中單寧含量仍然很高，與薯莨提取物相近，說明薯莨渣提取物同樣具備抑菌潛力。

表1 不同條件下提取物得率及其單寧含量Tab.1 The output rate of extracts and tannic acid content in extracts under different extraction method

2.2 薯莨提取物對(duì)真菌的抑制作用

測(cè)試了薯莨丙酮提取物（下面以“T”表示）對(duì)炭疽病菌H30、擬莖點(diǎn)霉H63和擬盤多毛孢屬真菌H69的抑制活性。噁霉靈是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的真菌殺菌劑，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3 mg/mL噁霉靈為陽性對(duì)照。結(jié)果表明，T液對(duì)H30有明顯的抑制作用，但抑制程度低于噁霉靈（圖1. a, b, c）；對(duì)H63菌絲的生長也有明顯抑制，濃度在100 mg/mL時(shí)的抑制程度接近3 mg/mL噁霉靈（圖1. d, e,f），而對(duì)H69無抑制作用(圖1. g, h, i)。

圖1 薯莨提取物對(duì)來自猴耳環(huán)的炭疽病菌H30、擬莖點(diǎn)霉H63和擬盤多毛孢屬真菌H69的抑制活性Fig.1 The antimicrobial activity of the extracts from Dioscorea cirrhosa to a species of Colletotrichum H30, a species of Phomopsis H63 and a species of Pestalotiopsis H69 from Archidendron lucidum

不同濃度的T液對(duì)H30和H63均有抑制活性，抑制效果隨濃度增大而增強(qiáng)，100 mg/mL的T液對(duì)H30的菌絲抑制率達(dá)46.2%；對(duì)H63的菌絲抑制率也達(dá)到31.9%，接近3 mg/mL噁霉靈的抑制率，150 mg/mL 的T液對(duì)H63的菌絲抑制率略高于3 mg/mL噁霉靈；測(cè)試濃度下，T液沒有表現(xiàn)出對(duì)H69的抑制效果（表2）。

表2 薯莨提取物對(duì)猴耳環(huán)真菌病原菌絲生長的影響Tab.2 The effects of Dioscorea cirrhosa extracts on three pathogenic fungi of A. lucidum

2.3 薯莨提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薯莨提取物對(duì)廣藿香青枯病菌株GHB2有顯著抑制效果，濃度越大抑菌效果越好，濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑14.3 mm，抑菌效果明顯（圖2a），低濃度下抑菌效果較弱，濃度為10 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑10 mm（圖2b）；5 mg/mL時(shí)，抑菌能力極微弱，但與空白對(duì)照相比，仍然能觀察到很小的抑菌圈（圖2c，表3）。

表3 不同濃度薯莨提取物對(duì)廣藿香青枯病菌GHB2的抑菌活性Tab.3 The antibacterial activity of different concentrations of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of P. cablin

圖2薯莨提取物對(duì)廣藿香青枯病菌GHB2的抑菌效果Fig.2 The antibacterial activity of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of Pogostemon cablin

3 結(jié)論與討論

提取植物活性成分的方法很多，不同植物原料、不同溶劑，不同料液比、不同浸提溫度和浸提時(shí)間等都會(huì)對(duì)提取物的得率和成分造成影響[12-14]。利用乙醇和丙酮浸提是兩種常用方法，有研究表明丙酮為溶劑提取薯莨單寧時(shí)，濃度以60%為好[10]，以乙醇為溶劑時(shí)，濃度在80%左右為佳[11]。本研究比較了60%丙酮和75%乙醇對(duì)薯莨單寧的提取效率及提取物中單寧含量的差異，發(fā)現(xiàn)不管是薯莨還是薯莨渣，以60%丙酮浸提獲得的產(chǎn)物得率更高、產(chǎn)物單寧含量也更高。因此，在本研究采用的提取方法中（見1.2.1），用丙酮浸提薯莨單寧比用乙醇浸提更合適。近期有報(bào)道用“乙醇+甘油”和“甲醇+甘油”等復(fù)合溶液為溶劑提取植物單寧，大大提高了產(chǎn)物得率[15]，未來可考慮利用類似的辦法進(jìn)一步改進(jìn)提取方法，提高產(chǎn)物得率。

猴耳環(huán)和廣藿香都是重要中藥材，種植過程中病害較多，對(duì)藥材產(chǎn)量和質(zhì)量影響大，藥材的用途決定了其病害的防治要更加注重綠色、無公害，開發(fā)植物源殺菌劑防治中藥植物病害具有良好的應(yīng)用前景。本研究選擇了分離自猴耳環(huán)病株的3種真菌：炭疽病菌、擬莖點(diǎn)霉、擬盤多毛孢菌，這些病菌能引起多種植物病害，具有代表性。測(cè)試了薯莨提取物對(duì)其抑制活性，結(jié)果顯示，薯莨提取物對(duì)炭疽病菌和擬莖點(diǎn)霉的菌絲生長有良好的抑制效果，說明薯莨提取物的確具備開發(fā)植物源殺菌劑的潛力，也可以考慮與其它藥劑進(jìn)行混配，形成互補(bǔ)，拓寬殺菌譜。研究也發(fā)現(xiàn)薯莨提取物對(duì)擬盤多毛孢真菌無作用，甚至在較低濃度下對(duì)擬盤多毛孢菌絲有輕微促生作用，說明其對(duì)真菌生長的抑制具有選擇性。對(duì)廣藿香青枯病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50 mg/mL的薯莨提取物對(duì)該菌具有良好抑制效果。導(dǎo)致植物青枯病的菌群復(fù)雜、變異多[16]，要將薯莨提取物開發(fā)成防治青枯病的藥劑，還需要測(cè)定其在植株上的實(shí)際防治效果。無論如何，薯莨提取物至少能夠抑制部分青枯病菌株的生長繁殖速度，可考慮制成無毒副作用的病害防治輔助劑，減輕病情，降低損失。

我國薯莨資源十分豐富，自然分布范圍廣，主要分布于南方中低海拔山區(qū)，廣東和廣西為薯莨的最高適生區(qū)，是當(dāng)前最密集的分布區(qū)域，在未來氣候變化的影響下，薯莨有進(jìn)一步向最高適生區(qū)即廣東、廣西兩省集中的趨勢(shì)[17]。目前，薯莨最多用于香云紗的制作工藝中,每到秋冬季節(jié)，數(shù)萬噸的薯莨廢渣經(jīng)風(fēng)干后直接被焚燒處理[18]，資源浪費(fèi)和環(huán)境污染較大。為充分利用本地薯莨資源，減少浪費(fèi)，減輕環(huán)境污染，本研究試圖從農(nóng)藥開發(fā)的角度探索薯莨利用的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，泡過水的薯莨渣中仍然含有大量單寧，提取物的得率是薯莨塊莖提取物得率的50%左右，提取物中單寧含量與薯莨提取物相仿，因此，薯莨渣提取物與薯莨提取物一樣具備開發(fā)成植物源農(nóng)藥的潛力。未來可從提高提取效率、降低提取成本方面進(jìn)一步研究薯莨單寧的大規(guī)模提取工藝，為實(shí)現(xiàn)薯莨資源的規(guī)?；玫於ɑA(chǔ)。

本研究明確了薯莨提取物對(duì)多種重要植物病原菌具有良好的直接抑菌效果，薯莨渣中亦提取到有效成分含量相同的提取物，對(duì)充分利用薯莨資源研發(fā)新型植物源殺菌劑、減少薯莨資源浪費(fèi)具有參考價(jià)值。