燕洪美 許學林 安富宇 王 凱 夏彥玲 華 彥

（1.東北林業(yè)大學 野生動物與自然保護地學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520）

穿山甲隸屬于哺乳綱Mammalia鱗甲目Pholidota鯪鯉科Manidae鯪鯉屬Manis，是全世界受非法貿(mào)易威脅最大的哺乳類之一[1-4]。目前，由于棲息地的碎片化和資源過度利用等導致主要分布于中國的中華穿山甲Manis pentadactyla野外種群數(shù)量急劇下降，瀕臨滅絕[5-7]。2017年瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約（CITES）已將全球現(xiàn)存的8種穿山甲納入附錄I中，禁止有關穿山甲的任何貿(mào)易。2020年，中國將中華穿山甲升為國家一級保護動物，并移出《藥典》[2]。因此，亟需進行遷地保護、人工繁育等工作，然后野化放歸實現(xiàn)種群復壯。

穿山甲發(fā)情鑒定主要依靠對動物生殖器形狀和分泌物的觀察[8]，根據(jù)發(fā)情期的特征進行判斷。妊娠鑒定主要通過B超等手段進行判斷[9]。但是這些方法對于穿山甲發(fā)情和妊娠鑒定并不準確或無法進行長期監(jiān)測。因此對沒有明顯外在發(fā)情特征的穿山甲發(fā)情判定及妊娠期的監(jiān)測，最有效的途徑就是分析其體內(nèi)激素水平的變化。血液樣品可以直接準確反映動物體內(nèi)激素水平的變化[10]，但對穿山甲連續(xù)采集血液，不僅會導致其產(chǎn)生應激，也對其正常的生理、行為產(chǎn)生影響。近年來研究表明糞便中的激素含量與血液中的激素含量有明顯的相關性[11]，因此可通過糞便激素水平監(jiān)測穿山甲的生理狀態(tài)。

穿山甲通常為單胎單只，偶有雙胞胎。Zhang等[12]報道吳詩寶曾在野外拍攝到兩只幼崽騎在一只雌性馬來穿山甲Manis javanica尾巴上，及獵人曾見到兩只同等大小的中華穿山甲幼崽騎在雌性穿山甲背上，表明它們生下了雙胞胎，但無其他證據(jù)進行佐證[8]。人工飼養(yǎng)條件下僅見1例馬來穿山甲產(chǎn)下雙胞胎[13]，但并未對胚胎進行形態(tài)測量與卵型鑒定。本研究對一例在人工飼養(yǎng)條件下受孕的雌性中華穿山甲合圈前及孕期糞便中激素含量進行了監(jiān)測，并對流產(chǎn)的雙胞胎胚胎進行測量及卵型鑒定，為中華穿山甲繁殖生理研究和人工繁育工作提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究穿山甲個體為2019年12月廣東省野生動物監(jiān)測救護中心救護的非法貿(mào)易個體，來源地點不詳。根據(jù)明顯的形態(tài)特征進行判斷，確定其為中華穿山甲。救護時動物體重為3.82 kg，救護兩周后，動物正常采食、活動，體況恢復正常。飼養(yǎng)6個月后，動物體重達到6.35 kg，確定雌雄獸遺傳距離較遠后，于2020年6月11日將人工飼養(yǎng)雄性中華穿山甲個體轉移到雌性籠舍內(nèi)開始合圈飼養(yǎng)，6月24日移出雄性個體。雌性個體流產(chǎn)日期為2020年8月22日，幼獸產(chǎn)出時已經(jīng)無生命特征，臍帶與母體分離，母獸無明顯受傷。

1.2 糞便收集及激素測定

合圈前，5月1日至20日每周收集雌性穿山甲糞便，5～7天采集一次，合圈期間（6月11日—6月24日）動物每次排便均進行收集，合圈結束后進入妊娠期，妊娠至流產(chǎn)期間（6月25日—8月25日）每3～5天收集一次糞便。使用無菌棉簽取糞便未被污染部分裝入采樣管中，標記動物編號和日期，收集完成后及時置于-20℃冰箱內(nèi)保存。共收集并檢測27份糞便。

將糞便于室溫下解凍，剔除稻草等雜物，置于研缽中，充分研磨并混勻。準確稱取研磨好的糞便1.5 g左右，裝入15 mL離心管中，加入10 mL 90%的甲醇溶液，震蕩1 min，使其混合均勻，在恒溫水浴振蕩器中萃取20 min后，2 000 rpm室溫離心20 min，取1 mL上清液分裝待測。同時準確稱取10 g研磨好的糞便，105℃烘干稱重，測定糞便中干物質的含量。

使用上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，按照說明書，檢測糞便樣本中雌二醇（E2）、睪酮（T）、促黃體素（LH）、促卵泡素（FSH）、催乳素（PRL）和孕激素（PROG）含量。

1.3 雙胞胎形態(tài)指標測量

測量和記錄胚胎的形態(tài)學指標：體重、體長、頭體長、前第三指爪長、后第三趾爪長、背鱗列數(shù)、背鱗行數(shù)、尾鱗列數(shù)和尾鱗行數(shù)等。流產(chǎn)雙胞胎體型較大的記為Z1(取中華穿山甲拼音首字母)，體型較小的個體記為Z2。

1.4 雙胞胎的卵型鑒定

微衛(wèi)星DNA（Short Tandem Repeat，STR）是廣泛存在于基因組內(nèi)的一種串聯(lián)重復序列。微衛(wèi)星標記具有豐富的多態(tài)性和一定保守性的特點，成為快速、簡便地個體識別的首選標記[14-15]。本研究使用肌肉組織用于雙胞胎卵型的鑒定。選擇10個已報道的馬來穿山甲STR位點進行鑒定[16]（表1）。

表1 用于穿山甲卵型鑒定的STR序列Table 1 The sequence of STR used in zygosity diagnosis of pangolin

聚合酶鏈反應（PCR）體系為25 μL，正向引物用熒光染料標記。PCR條件如下：92 ℃3 min；30個循環(huán)（92 ℃ 30 s；引物特異性退火72 ℃ 30 s）；最后72 ℃ 5 min。所得PCR產(chǎn)物在ABI 3100自動測序儀上進行毛細管電泳，并使用Genemapper 3.7分析片段大小和基因型。

基于10個位點，兩個體具有相同的多位點基因型的概率為0.000 37，這表明10個位點的集合足以識別個體（PIsib ＜0.01），10個位點均一致時，同卵概率為99.963%[17]。 如果所有位點的所有等位基因均相同，則判定為同卵雙胞胎。如果只發(fā)現(xiàn)一個等位基因的一個錯配，則重新提取DNA，如果它仍然不同，判定雙胞胎為異卵。如果等位基因在兩個或兩個以上的位置上存在差異，則認為該雙胞胎為異卵雙胞胎[14]。

2 結果與分析

2.1 生殖激素變化

檢測雌性穿山甲糞便中的激素發(fā)現(xiàn)：合圈前和合圈期間各激素濃度變化不大，基本維持在同一水平，妊娠至流產(chǎn)期間各激素水平變化較為明顯。雌二醇含量在合圈前和合圈期間呈現(xiàn)波動性變化，維持在663.108～17.92 pmol/L，在開始妊娠后則出現(xiàn)上升趨勢，維持在827.30～1 050.14 pmol/L ，在妊娠第7周達到最高（1 050.14 pmol/L）（圖1a）；交配后睪酮激素含量無明顯變化,在7.58～13.33 nmol/L間波動性變化（圖1b）；促黃體素含量在合圈前和合圈期間維持在31.29～40.55 mIU/mL，開始妊娠后含量持續(xù)升高，維持在39.68～53.95 mIU/mL，妊娠第4周達到最高（53.95 mIU/mL）后出現(xiàn)下降趨勢（圖1c）；促卵泡素含量在合圈期間波動性變化，維持在15.50～20.06 mIU/mL，開始妊娠后大幅度上升，維持在19.43～26.08 mIU/mL，在妊娠第5周達到最高（26.08 mIU/mL）后開始出現(xiàn)下降（圖1d）；孕酮含量在合圈期間波動性變化，維持在12.78～15.62 ng/mL，開始妊娠后大幅度升高，維持在16.85～22.57 ng/mL，在妊娠第2周達到最高后（22.57 ng/mL），呈現(xiàn)波動性變化，但整體表現(xiàn)為下降趨勢（圖1e）；交配前后催乳素含量無明顯變化，在797.15～1057.04 mIU/L間波動性變化，在妊娠第6周開始出現(xiàn)大幅度的下降趨勢，并在8月22日（流產(chǎn)當天）降至最低點（797.15 mIU/L）（圖1f）。

圖1 雌性穿山甲糞便中雌二醇（a）、睪酮（b）、促黃體素（c）、促卵泡素（d）、孕酮（e）和催乳素（f）的含量變化Fig. 1 Changes of estradiol (a), testosterone (b), luteinizing hormone (c), follicle stimulating hormone (d), progesterone (e)and prolactin (f) in the feces of female pangolin

2.2 雙胞胎的形態(tài)特征

雙胞胎體型存在差異，Z1總長15.8 cm，體重25.4 g；Z2總長13.6 cm，體重18.3 g。兩個體背部甲片與尾部甲片行列數(shù)相同；Z1、Z2前爪長差異較大，后爪長度接近（表2）。

表2 中華穿山甲流產(chǎn)雙胞胎形態(tài)學測量指標Table 2 Measurement of the morphological index of the Chinese pangolin’s cubs

兩胚胎頭部具備基本形態(tài)，無鱗片覆蓋；尾部發(fā)育較好，鱗片基本覆蓋完全；身體軀干背部發(fā)育較好，鱗片覆蓋完全；四肢具備形態(tài)，部分覆蓋鱗片，四爪形狀良好，未角質化；可看到未發(fā)育完全的眼；唇部初步具備形態(tài)，舌頭發(fā)育成型；胸腔可看到明顯的肋骨輪廓；腹腔可看到部分腸道形態(tài)（圖2）。

圖2 中華穿山甲流產(chǎn)的雙胞胎Fig.2 The twins stillbirths of the Chinese pangolin

2.3 雙胞胎的卵型

通過比較10個微衛(wèi)星位點上雙胞胎基因型的一致性，進行雙胞胎卵型鑒定。在檢測的10個STR位點中，雙胎個體Z1與Z2僅有4個位點的基因型結果表現(xiàn)一致，在其余6個位點的基因型均表現(xiàn)出差異，表明該雙胞胎為異卵雙胞胎（表3）。

表3 中華穿山甲雙胞胎基因型Table 3 The Genotype of Chinese pangolin twins

3 討論

迄今為止，關于穿山甲繁殖雙胞胎的相關報道較少。穿山甲通常為單胎單只，過去幾十年報道了約30例野外與人工飼養(yǎng)穿山甲自行分娩產(chǎn)仔案例，及9例解剖案例，都為單胎[12,18-25]。

這些報道表明穿山甲可能產(chǎn)出雙胞胎。但在人工飼養(yǎng)條件下，還未有報道。僅有Yan等[13]報道了2016—2020年10只馬來穿山甲在野外交配后，懷孕29次，在人工飼養(yǎng)條件下產(chǎn)仔，僅一例產(chǎn)下雙胞胎，其中一只幼崽出生當天死亡，但并未對其進行相關研究。由此可見，穿山甲產(chǎn)雙胞胎的幾率不高，但值得研究積累相關資料和養(yǎng)護經(jīng)驗，提高人工繁育效率。

不同生理時期動物激素的水平能夠反應動物的生理狀態(tài)，因此通過激素水平可以為了解動物的繁殖生理提供參考。非損傷取樣廣泛應用于野生動物性激素檢測等研究，目前普遍傾向于使用易于收集和保存的糞便進行測定[26-28]。研究表明血漿與糞便性激素有較強的相關性，并且有些激素在糞便中的含量與血液中含量呈正比[29-30]。Chin等[31]研究表明穿山甲交配前血清中孕酮含量在2.97～18.50 ng/mL，交配后三周直至分娩期間孕酮含量維持在28.5～55.0 ng/mL。與本研究中孕酮水平變化趨勢相似。本研究表明在中華穿山甲受孕后，糞便中雌二醇、促黃體生成素、促卵泡素和孕酮水平明顯上升，催乳素和睪酮則變化不大。并且流產(chǎn)前孕激素最先出現(xiàn)波動性的下降趨勢后，促黃體素、促卵泡素和催乳素陸續(xù)出現(xiàn)下降趨勢，并在流產(chǎn)當天催乳素水平降至最低。高濃度的孕酮作用于子宮，有利于胚胎的穩(wěn)固，維持受精卵的著床，減少流產(chǎn)。從胚胎發(fā)育情況看，兩個胚胎均發(fā)育不全，不是正常孕期分娩，并且母獸的孕激素最先出現(xiàn)下降趨勢，然后促黃體素、促卵泡素和催乳素在流產(chǎn)前陸續(xù)出現(xiàn)了下降趨勢，可能是幼崽在子宮內(nèi)死亡后，母獸主動流產(chǎn)。雖然糞便測定激素與體內(nèi)循環(huán)激素水平存在一定的時差，但作為無損傷少干擾的取樣測定方法，并且與血清中激素水平變化相似，因此糞便激素可以反應動物的繁殖狀態(tài)，作為孕期穿山甲監(jiān)測具有可行性?；诒狙芯砍醪浇Y果，中華穿山甲糞便中孕激素、促卵泡素、促黃體素含量在妊娠期間變化較為明顯，流產(chǎn)前也有不同程度的下降，推薦作為穿山甲妊娠期生理狀態(tài)監(jiān)測的主要指標，有助于判斷其懷孕情況并及時給予保育措施。

雙胞胎可分為同卵雙胞胎與異卵雙胞胎兩類。同卵雙胞胎可能由早期胚胎分裂形成，基因組DNA差異較小，表型差異不大；異卵雙胞胎是由兩個卵子同時或幾乎同時受精形成的雙胞胎，基因組DNA并不完全一致，在表型上可能具有較大差異[31]。本研究中雙胞胎發(fā)育程度相近，但體型存在差異，卵型鑒定確定為異卵雙胞胎。研究發(fā)現(xiàn)馬來穿山甲的卵泡發(fā)育場所較少，符合單胎單只哺乳動物繁殖解剖學特征，但仍有報道多例馬來穿山甲兩側卵巢同時存在黃體，這表明穿山甲雖為單胎動物，但仍有可能一次或較短間隔內(nèi)排出兩個卵子，產(chǎn)生雙胞胎。

目前關于穿山甲胚胎發(fā)育的研究較少，妊娠期時長也不一致。Zhang等[12]報道了6種未發(fā)育完全的馬來穿山甲胚胎形態(tài)，但無法確定發(fā)育時間。本研究中兩胚胎發(fā)育時間在11周左右，兩胚胎的尾巴和背部有甲片覆蓋，頭部和四肢無甲片；舌頭發(fā)育成型；甲片及四爪形態(tài)良好，均未角質化。本研究中兩胚胎的背鱗行數(shù)與尾巴一側鱗片列數(shù)，與張富華等[32]報道的發(fā)育完全的中華穿山甲胎兒的數(shù)據(jù)一致，表明尾部與背部鱗片已經(jīng)覆蓋完全。

當前對于穿山甲繁殖生物學的基礎研究多數(shù)來自馬來穿山甲，中華穿山甲的相關研究相對較少。本文報道的中華穿山甲雙胞胎案例表明，穿山甲雖為單胎動物，但可以孕育雙胞胎，并且可以在短時間內(nèi)排出兩個卵子。這對穿山甲的繁殖生理研究提供了基礎數(shù)據(jù)，并對穿山甲的人工飼養(yǎng)與繁育工作提供了參考。