王莉蘭,周春祥,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.南京明基醫(yī)院中醫(yī)部,江蘇 南京 210019)

β淀粉樣蛋白(β-Amyloid,Aβ)沉積是阿爾茲海默病 (Alzheimer's disease,AD) 的核心病理事件,通過其神經(jīng)毒性作用參與AD進展[1]。通常,腦內(nèi)過多的Aβ主要通過自噬-溶酶體系統(tǒng)、星形膠質(zhì)細胞(Astrocytes,AS)分泌的蛋白酶和小膠質(zhì)細胞(Microglia,MG)吞噬作用進行降解清除,還可通過血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)和/或腦淋巴引流系統(tǒng)轉(zhuǎn)運排出[2]。降解和轉(zhuǎn)運途徑的結(jié)構(gòu)或功能異常,可引起Aβ沉積繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng),最終形成“Aβ轉(zhuǎn)運與降解障礙-Aβ沉積-炎癥”的惡性循環(huán)。研究證實腦膜淋巴功能障礙與小鼠和人類小膠質(zhì)細胞激活有關(guān)[3],小膠質(zhì)細胞激活是神經(jīng)炎癥發(fā)生的必要過程;免疫細胞亞型CD4+Th17和 Th1淋巴細胞會分泌獨特的效應(yīng)細胞因子(如IL-17、IFN-γ等),這些細胞因子可能會誘導(dǎo)BBB出現(xiàn)功能障礙[4],同時炎癥也會影響到自噬及星形膠質(zhì)細胞的內(nèi)吞作用[5-6]。

“Aβ沉積-炎癥-脾虛飲停-溫脾化飲”之間具有明確的邏輯關(guān)系[7],Aβ沉積可能是AD脾虛飲停的證候?qū)嵸|(zhì)之一。同時,脾主運化功能酷似Aβ在腦內(nèi)轉(zhuǎn)運與降解的過程,脾運失健則會使得Aβ清除障礙。溫脾化飲代表方苓桂術(shù)甘湯已被證實可顯著抑制由Aβ沉積引起的神經(jīng)炎癥[8],課題組前期研究還證實了苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)節(jié)血腦屏障和類淋巴系統(tǒng)促進Aβ清除,并可干預(yù)影響Aβ的轉(zhuǎn)運和降解的相關(guān)蛋白或靶標(biāo)[9-11]?；谏鲜鲅芯?我們提出如下假說:苓桂術(shù)甘湯不僅可通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)影響Aβ的轉(zhuǎn)運和降解過程,還可能直接干預(yù)Aβ轉(zhuǎn)運與降解途徑,減少Aβ沉積,起到“運化并舉”防治AD的作用(圖1)。

圖1 苓桂術(shù)甘湯“運化并舉”防治AD示意圖

本文對Aβ轉(zhuǎn)運及降解途徑及機制進行概述,并分析苓桂術(shù)甘湯干預(yù)Aβ轉(zhuǎn)運與降解途徑的研究現(xiàn)狀,探討該方“運化并舉”防治AD的可行性,充實“脾主運化”的科學(xué)內(nèi)涵,為AD防治提供新思路。

1 腦內(nèi)Aβ代謝途徑及機制概述

腦內(nèi)過多的Aβ依靠降解和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實現(xiàn)清除：①通過自噬-溶酶體系統(tǒng)、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用進行降解；②通過血腦屏障和/或腦淋巴引流系統(tǒng)轉(zhuǎn)運排出。如圖2所示，Aβ可能通過自噬、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞實現(xiàn)降解;并可能通過BBB轉(zhuǎn)運至血液,此過程依附于LRP1,P-gp和RAGE等相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白,血液中的Aβ將會進入肝腎系統(tǒng)進行清除;Aβ可能通過腦淋巴引流系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至腦脊液,并轉(zhuǎn)運至頸部淋巴管實現(xiàn)清除,其中AQP-4對Aβ的引流至關(guān)重要。上述途徑的結(jié)構(gòu)或功能異常會導(dǎo)致Aβ聚集體沉積，一方面誘發(fā)腦內(nèi)大量老年斑形成，直接作用于神經(jīng)元，產(chǎn)生毒性作用；另一方面激活腦內(nèi)的AS、MG，產(chǎn)生炎癥因子并誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，激活的MG在AD病程早期即可吞噬突觸，造成神經(jīng)損傷[12]。維持Aβ轉(zhuǎn)運與降解系統(tǒng)的正常功能，減少Aβ沉積能夠很大程度上改善AD的病理。

圖2 Aβ的降解及轉(zhuǎn)運途徑示意圖[13]

1.1 腦內(nèi)Aβ降解途徑及機制概述

MG的吞噬作用和AS分泌的蛋白酶是Aβ實現(xiàn)降解清除的主要途徑之一。AD早期,MG激活會增強其趨化、吞噬能力,增加Aβ清除,進而對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。其中,Aβ的清除很大程度上依賴于腦內(nèi)MG的吞噬作用,MG在被Aβ激活之后可以起到吞噬Aβ聚集物和壞死神經(jīng)細胞的作用,以實現(xiàn)聚集Aβ的清除[14]。而在AD進展期,大量Aβ聚集體沉積能異常激活MG,通過釋放炎癥介質(zhì)損害神經(jīng)元、參與補體蛋白C1q介導(dǎo)的突觸丟失、增強tau蛋白磷酸化而加劇神經(jīng)元破壞[15]?？梢夾D不同病理階段,MG有著不同的功能,對其實施精準調(diào)控顯得尤為重要。而AS激活后會表達外排轉(zhuǎn)運蛋白LRP1、Aβ流入轉(zhuǎn)運蛋白晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)、膜相關(guān)蛋白聚糖等受體以識別并結(jié)合Aβ,隨后通過多種降解酶介導(dǎo)Aβ的清除,如胰島素降解酶、腦啡肽酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-2/-9(Matrix metallo proteinase,MMP-2/-9)[16-17]。

越來越多的證據(jù)表明自噬-溶酶體途徑能夠清除Aβ[18]。正常情況下,Aβ肽被β-分泌酶從淀粉樣前體蛋白上切割下來產(chǎn)生膜連接末端片段CTFβ,這些物質(zhì)通過特定的信號基序被遞送至溶酶體內(nèi),并經(jīng)由自噬小體進行降解,以維持適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)水平并避免其積累的有害影響[19]。AD病理進程中,該系統(tǒng)的功能障礙往往先于Aβ沉積物的積聚,表現(xiàn)為自噬小體成熟缺陷并在神經(jīng)元內(nèi)堆積,自噬小體和溶酶體區(qū)室之間的融合步驟被破壞,自噬途徑受損,最終導(dǎo)致Aβ大量聚集,成為神經(jīng)元中主要的細胞內(nèi)毒肽[20],維穩(wěn)自噬-溶酶體系統(tǒng)對實現(xiàn)Aβ的清除至關(guān)重要。自噬相關(guān)基因(Autophagy related genes,ATGs)在自噬過程中發(fā)揮重要作用,輕鏈蛋白3(LC3/ATG8)能在ATG4作用下與磷脂酰乙醇胺結(jié)合,從非活性形式的LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為活性形式的LC3Ⅱ,這一過程是自噬小體形成的關(guān)鍵步驟,LC3Ⅱ也被認為是自噬的標(biāo)志性蛋白[21]。

1.2 腦內(nèi)Aβ轉(zhuǎn)運途徑及機制概述

研究表明,腦淋巴引流系統(tǒng)是腦細胞間隙Aβ清除的重要模式[22]。以類淋巴系統(tǒng)和腦膜淋巴管為核心的腦淋巴引流系統(tǒng)實現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Aβ的高效率清除,腦脊液-間質(zhì)液交換后流經(jīng)間質(zhì)時會將其中的細胞外Aβ通過靜脈旁通路引流至腦膜淋巴管,再流向頸部淋巴管實現(xiàn)清除[23]。作為類淋巴系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu),水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP-4)對Aβ的引流至關(guān)重要,AQP-4的表達水平是影響類淋巴系統(tǒng)引流Aβ的重要因素,腦脊液隨著動脈搏動在AQP-4的作用下從動脈周圍間隙進入腦細胞外間隙,AQP-4缺失及極性分布紊亂可導(dǎo)致Aβ清除減少,促進AD的形成與發(fā)展[24]。大多數(shù)AQP-4存在于星形膠質(zhì)細胞末端,由于其特殊的定位,AQP-4將星形膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)與間質(zhì)液連接起來,從而產(chǎn)生與全身組織水動力學(xué)不同的動態(tài)流體,從而促進間質(zhì)運動,這對于類淋巴引流至關(guān)重要[25]。

腦內(nèi)Aβ經(jīng)BBB轉(zhuǎn)運占中樞神經(jīng)系統(tǒng)Aβ總清除率的四分之一[26]。BBB功能障礙和Aβ沉積之間存在惡性循環(huán),一項最近的研究觀察到AD患者大腦結(jié)構(gòu)中緊密聯(lián)結(jié)破壞、BBB通透性增加以及轉(zhuǎn)運蛋白表達水平降低,這些發(fā)現(xiàn)表明Aβ可能是破壞BBB完整性和緊密聯(lián)結(jié)的最初原因,當(dāng)BBB功能障礙又會難以進行Aβ的正常轉(zhuǎn)運[27]。可見,BBB轉(zhuǎn)運Aβ主要取決于兩個因素:Aβ轉(zhuǎn)運蛋白和BBB完整性。Aβ轉(zhuǎn)運蛋白包括LRP1、P-糖蛋白1和RAGE[28];此外,在腦組織中,MMP-2/-9是造成BBB完整性受到損害的主要因素之一,腦缺血小鼠再灌注期間的MMP-2/-9活性增加,血腦屏障也具有更高的通透性[29]。

需要明確的是,Aβ的降解和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)并非完全獨立的,兩者存在相互關(guān)聯(lián)和影響的現(xiàn)象。如自噬與BBB有著密切聯(lián)系,大腦皮層和海馬中BBB的自噬相關(guān)PI3K/Akt/mTOR信號通路以年齡依賴性方式被調(diào)低,從而促進AS的轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)自噬[30]。

2 脾主運化與Aβ代謝關(guān)聯(lián)分析

《素問·經(jīng)脈別論篇》:“飲入于胃,游溢精氣,上輸于脾,脾氣散精,上歸于肺,通調(diào)水道,下輸膀胱,水精四布,五經(jīng)并行?！痹摋l文形象闡釋了脾主運化的過程,脾通過“運化”不僅能消化、吸收飲食中的精微物質(zhì),更可消除、排出體內(nèi)的糟粕。具體而言,脾以“化”將胃納入的水飲、谷物消化為人體所需精微物質(zhì),脾以“運”將體內(nèi)精微轉(zhuǎn)輸至五臟六腑,并能參與體內(nèi)多余糟粕的排泄,如痰、飲、水濕等病理產(chǎn)物?！斑\”和“化”相輔相成,實現(xiàn)人體正常的精微物質(zhì)代謝,如若脾運功能障礙,脾不足以吸收人體精微,將精微運輸至臟腑或排除多余糟粕更是困難。

從上文可知,Aβ通過降解和轉(zhuǎn)運實現(xiàn)清除屬人體正常的生理活動,從中醫(yī)取象比類的角度來看,脾之“運化”過程酷似Aβ在體內(nèi)的降解與轉(zhuǎn)運的過程,其中通過自噬-溶酶體系統(tǒng)、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用降解神經(jīng)元內(nèi)積聚的Aβ過程屬于脾主“化”的內(nèi)容;通過腦淋巴引流系統(tǒng)、BBB轉(zhuǎn)運Aβ至頸外淋巴、血漿的過程屬于脾主“運”的范疇(圖3)。細推其理,整體觀念是中醫(yī)哲學(xué)觀的基礎(chǔ),人為整體,臟腑經(jīng)絡(luò)各司其職;中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦屬獨立整體,神經(jīng)元、蛋白酶、屏障結(jié)構(gòu)等各守其位。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)精密性的延展,可直接觀測到臟腑與微細結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián),譬如前文提到Aβ沉積可能是AD脾虛飲停的證候?qū)嵸|(zhì)之一。引而伸之,脾之運化功能維持人體精微正常輸布的作用可關(guān)聯(lián)到Aβ的代謝。脾之運化功能正常,Aβ的降解和轉(zhuǎn)運功能不易失調(diào);脾之運化功能障礙,可能會導(dǎo)致Aβ的代謝異常,換言之Aβ的降解和轉(zhuǎn)運功能異常時可從脾失運化的角度進行論治。

圖3 脾“運化”Aβ的取象比類示意圖

3 苓桂術(shù)甘湯“運化并舉”干預(yù)Aβ代謝的基礎(chǔ)探析

脾主運化功能參與Aβ代謝,脾運健旺則可維持Aβ的正常轉(zhuǎn)運與降解,當(dāng)脾主運化功能受損,Aβ在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運與降解的某一作用鏈條失效,則會導(dǎo)致Aβ代謝異常,發(fā)生沉積,進而影響AD進展。脾虛飲停是AD的重要病機[31],溫脾化飲代表方苓桂術(shù)甘湯在AD相關(guān)研究中取得了長足發(fā)展,尤其在干預(yù)Aβ代謝方面頗具優(yōu)勢[9,11,32-34]。

3.1 苓桂術(shù)甘湯通過干預(yù)脾“化”功能參與Aβ降解

基于中醫(yī)取象比類，自噬-溶酶體系統(tǒng)、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用降解神經(jīng)元內(nèi)積聚的Aβ過程屬于脾主“化”的內(nèi)容。苓桂術(shù)甘湯能夠干預(yù)上述有關(guān)脾"化"的功能參與Aβ降解，郭一等證實苓桂術(shù)甘湯能夠激活細胞自噬,其主要體現(xiàn)在可升高自噬相關(guān)基因ATG5表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值[34],一項最新的研究發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯還能夠調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因ATG3[35]。苓桂術(shù)甘湯的組成藥物中多種主要成分可發(fā)揮調(diào)節(jié)自噬的作用,如甘草酸和茯苓酸[36-37]。

苓桂術(shù)甘湯可調(diào)節(jié)AS激活后表達的RAGE、LRP1受體[9],還能影響小鼠急性心肌損傷時MMP-2/-9的表達,MMP-9是參與Aβ清除的重要降解酶,我們有理由認為苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)節(jié)RAGE、LRP1、MMP-9的表達促進AS與更多的受體結(jié)合或分泌相關(guān)蛋白酶促進Aβ清除,當(dāng)然這仍需進一步的試驗證實。本課題組還證實了苓桂術(shù)甘湯能夠抑制MG產(chǎn)生的促炎細胞因子水平,減輕Aβ沉積誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[9]。另有研究發(fā)現(xiàn),甘草有效成分在AD中具有穩(wěn)定MG的作用,具體表現(xiàn)為異甘草素抑制激活小膠質(zhì)細胞ERK1/2活性和促炎因子[38],甘草素則可以通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的M1/M2轉(zhuǎn)化來降低Aβ水平[39],從而改善AD小鼠的突觸可塑性下降、tau蛋白過度磷酸化和記憶缺陷的行為學(xué)表現(xiàn)。

3.2 苓桂術(shù)甘湯通過干預(yù)脾“運”功能參與Aβ轉(zhuǎn)運

此外，腦淋巴引流系統(tǒng)、BBB轉(zhuǎn)運Aβ至頸外淋巴、血漿的過程屬于脾主“運”的范疇。苓桂術(shù)甘湯能夠干預(yù)上述有關(guān)脾“運”的功能參與Aβ轉(zhuǎn)運，該方干預(yù)類淋巴引流調(diào)控Aβ轉(zhuǎn)運已得到中醫(yī)理論和實驗研究支持,如寧晚玲等詳細闡發(fā)了脾虛致脾主運化水液功能異常時介導(dǎo)水跨膜轉(zhuǎn)輸?shù)腁QP-4功能狀態(tài)的改變[40];苓桂術(shù)甘湯及其合方還可調(diào)節(jié)胸腔積液模型大鼠小腸上段AQP-4和其他消化道水通道蛋白表達[41-42]。在AD中,苓桂術(shù)甘湯可能通過調(diào)控炎癥以及Aβ轉(zhuǎn)運影響腦淋巴引流途徑,改善腦部微環(huán)境[31],進一步實驗表明該方通過降低AQP-4相關(guān)的白細胞介素-1β水平改善由腦淋巴阻斷引起的皮質(zhì)損傷,發(fā)揮保護神經(jīng)元功能,延緩AD進展[11]。

苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)節(jié)血腦屏障Aβ轉(zhuǎn)運蛋白促進Aβ清除,以雙側(cè)腦室注射Aβ法建立AD大鼠模型,發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)控MAPK和NF-κB信號通路抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生,并可通過調(diào)節(jié)Aβ轉(zhuǎn)運蛋白LRP-1和RAGE的表達,和促進相關(guān)骨架蛋白如跨膜密蛋白-5、外周支架蛋白-1和閉合蛋白等的表達,進而促進Aβ轉(zhuǎn)運實現(xiàn)Aβ清除[9,43],另有學(xué)者證實了苓桂術(shù)甘湯可抑制小鼠急性心肌損傷時MMP-2/-9的過表達[44],表明苓桂術(shù)甘湯能影響MMP-2/-9的表達,而MMP-2/-9是造成BBB完整性受到損害的主要因素,苓桂術(shù)甘湯可能通過干預(yù)MMP-2/-9的表達發(fā)揮保護BBB完整性的作用。本課題組已證實苓桂術(shù)甘湯對AD體外血腦屏障損傷具有修復(fù)作用,其機制可能與抑制炎癥因子和MMP-2、MMP-9表達有關(guān)[43]。

4 結(jié)語

基于上述對Aβ代謝途徑及機制的認識,苓桂術(shù)甘湯可通過抗炎作用干預(yù)AD進程,結(jié)合該方具有促進AS分泌降解酶、增強MG吞噬作用、調(diào)節(jié)自噬、促進類淋巴引流、保護BBB實現(xiàn)Aβ清除的藥理作用,我們有理由認為苓桂術(shù)甘湯能實現(xiàn)“運化并舉”全方位干預(yù)Aβ代謝的作用,維持Aβ的產(chǎn)生和清除平衡,延緩AD進展。深入挖掘苓桂術(shù)甘湯“運化并舉”實現(xiàn)Aβ轉(zhuǎn)運與降解的潛在機制,有助于闡釋脾主運化與腦內(nèi)Aβ代謝的相互關(guān)系,進一步完善溫脾化飲法治療AD的生物學(xué)機制,也可在一定程度上揭示AD脾失運化的證候?qū)嵸|(zhì),為中醫(yī)藥防治AD提供新視角。