徐 銳，熊澤浩，朱旭東，周賓寒，侯澤豪，許嘉盛，羅旖柔，方正武

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025)

隨著全球環(huán)境的變化，干旱、高溫、鹽堿等非生物脅迫已經(jīng)成為影響植物正常生長的關(guān)鍵因素。蕎麥?zhǔn)寝た?Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill)藥食兩用的草本植物，主要分為苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn)、甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)兩個(gè)栽培種。其中甜蕎作為一種重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，在我國北方干旱地區(qū)得到了大量種植。因此，開展蕎麥抗逆研究對于培育植物抗逆新品種具有重要意義。

熱激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)也被稱為熱休克蛋白，是植物遭遇高溫等非生物脅迫時(shí)誘導(dǎo)生物體合成的一類保護(hù)性蛋白。大多數(shù)真核細(xì)胞生物體內(nèi)都有種類豐富的HSPs存在[1]，一般根據(jù)蛋白質(zhì)大小以及同源關(guān)系，將其分為五大類，分別是HSP60、HSP70、HSP90、HSP110和小分子量sHSP 家族[2]，其中HSP90家族蛋白主要存在于真核細(xì)胞中，約占細(xì)胞蛋白總數(shù)的1%～2%[3]；在結(jié)構(gòu)上包含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，N-端為ATP酶結(jié)合域、C-端含有二聚合體結(jié)合區(qū)，中間段為氨基酸，是一個(gè)主要受ATP調(diào)控的二聚體伴侶蛋白[4]。已有研究表明HSP90在控制細(xì)胞周期、細(xì)胞生存、激素等多個(gè)細(xì)胞過程中扮演重要角色[5]，且與其他蛋白間存在互作關(guān)系，如Hsp40、p23FKBP52等[6]。近年來，HSP90家族研究逐漸成為熱點(diǎn)[7]。另外，HSP90作為一種功能專一的蛋白折疊工具，在生物體的存活和逆境脅迫應(yīng)答方面有著重要意義[8]。同時(shí)HSP90作為分子伴侶，參與輔助了其他蛋白的合成與加工，在生物體機(jī)能維護(hù)方面起到了極其重要的作用[9]。

目前HSP90家族在辣椒(CapsicumannuumL.)[10]、南瓜(Cucurbitamoschata)[11]、番茄(Solanumlycopersicum)[12]等植物中得到了廣泛的研究，但其在甜蕎逆境脅迫條件下的分析卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以‘西農(nóng)9976’為材料開展研究，通過同源克隆的方法得到蕎麥FeHSP83基因序列，在此基礎(chǔ)上對該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過進(jìn)化樹親緣關(guān)系比對，發(fā)現(xiàn)其隸屬于HSP90家族成員，與此同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR的方法探究該基因在干旱、鹽脅迫條件下的表達(dá)情況，分析該基因在蕎麥中的表達(dá)模式，為蕎麥培育抗旱抗鹽品種提供優(yōu)異的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料、生長條件及脅迫處理

試驗(yàn)用甜蕎品種為‘西農(nóng)9976’，挑選飽滿無病害的種子，經(jīng)消毒沖洗后，置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫催芽，待種子長出根時(shí)，將長勢相同的蕎麥種子移栽至水培盒中，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。待幼苗長出2～3片真葉后，使用15% PEG 6000溶液和0.1% NaCl溶液對蕎麥幼苗進(jìn)行脅迫處理，在分別處理3、6、12、24、48 h后對幼苗和根部進(jìn)行取樣，將脅迫前的材料作為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生理學(xué)重復(fù)，樣品通過液氮速凍后放置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試儀器與試劑

PCR擴(kuò)增采用Bio-rad T-100 PCR儀(美國Bio-rad公司)；凝膠成像儀購自上海培清科技有限公司。RNA提取試劑盒(RN38)購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)及金牌MIX購自北京擎科生物科技有限公司；熒光定量試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞引物合成和DNA測序也均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 FeHSP83基因克隆

蕎麥嫩葉基因組DNA，總RNA提取法參考CTAB法[13-14]，得到RNA后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，具體試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，使用引物FeHSP83-F/FeHSP83-R(表1)對基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，上下游引物各1.5 μL，金牌MIX 45 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物使用1.0%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測，產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。參照凝膠試劑盒回收目的條帶，采用007VS載體連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過AMP抗生素進(jìn)行篩選，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1.4 FeHSP83基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站ORF Finder分析目標(biāo)基因編碼區(qū)；利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析目標(biāo)基因基本理化特性；利用MEGA7.0軟件，以鄰接法(Neighbor-joining，NJ；bootstrap=1000)構(gòu)建進(jìn)化樹；通過WOLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html) 在線軟件進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 FeHSP83基因的qRT-PCR分析

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，將其稀釋10倍后用于熒光定量分析。設(shè)計(jì)FeHSP83基因?qū)?yīng)的熒光定量引物，根據(jù)TB Green(TaKaRa，大連)熒光定量試劑盒操作說明書在CFX96 real-time PCR 儀器(美國BioRad公司)上進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL、100 ng cDNA模板、引物各0.6 μL和10 μLPCR-mix(2×)。qRT-PCR反應(yīng)體系為：95℃，30s，(95℃，10s；55℃，30s)×40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)以β-Actin為內(nèi)參基因，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過CK對樣品做標(biāo)準(zhǔn)化處理，并使用2-ΔΔct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Excel 2019和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，最后使用Excel 2019軟件繪制基因表達(dá)量的柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FeHSP83基因的克隆

以甜蕎cDNA為模板，使用表1中的引物進(jìn)行擴(kuò)增，連接007VS載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用AMP抗生素篩選陽性克隆，成功獲得了目的條帶，通過觀察PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖(圖1)可知，PCR擴(kuò)增得到的長度大約為2 100 bp，與預(yù)期的片段大小基本一致。通過BLAST對比發(fā)現(xiàn)，甜蕎HSP83基因與藜麥HSP83基因同源性達(dá)到80%以上，證實(shí)在西農(nóng)9976中獲得了HSP83基因，將其命名為FeHSP83。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 FeHSP83蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與序列分析 通過ProtParam軟件對FeHSP83蛋白理化特性分析表明，該基因蛋白相對分子量約為80.97 kDa，理論等電點(diǎn)為4.96，總共包括11408個(gè)原子，分子式為C3592H5721N933O1137S25。在組成FeHSP83編碼蛋白的704 個(gè)氨基酸中，谷氨酸(Glu)含量最高，達(dá)到了12.5%，負(fù)電荷殘基143個(gè)，正電荷殘基109個(gè)，脂溶指數(shù)為82.56，蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為41.03，具有較強(qiáng)親水性。

2.2.2 FeHSP83蛋白的同源比對和進(jìn)化分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫，將FeHSP83基因編碼的氨基酸序列與甜菜(BvHSP83)、黎麥(CqHSP83)、花生(AhHSP83)的HSP83氨基酸序列進(jìn)行對比(圖2)，結(jié)果顯示，其蛋白氨基酸長度極為相似，同源性達(dá)97.06%，說明FeHSP83蛋白在這幾個(gè)作物中存在較高的相似性。

圖2 FeHSP83與其他物種同源蛋白的多序列比對分析結(jié)果Fig.2 Multi-alignment of FeHSP83 amino acid sequence with other HSP83s

通過進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)甜蕎FeHSP83蛋白與甜菜、藜麥HSP83蛋白的親緣關(guān)系較近，與番茄、辣椒等作物的HSP83蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)，同一分支上的甜菜、藜麥與甜蕎都為藜科植物，這種進(jìn)化關(guān)系符合形態(tài)學(xué)分類規(guī)律，由此我們可推測FeHSP83基因具有較高的保守性。

圖3 FeHSP83與其他物種HSP83蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of FeHSP83 with other HSP83-like proteins

2.2.3 FeHSP83蛋白亞細(xì)胞定位 WOLF PSORT預(yù)測表明，該蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)，推測其編碼蛋白可能在細(xì)胞核外發(fā)揮作用。使用SWISS-MODEL網(wǎng)站對FeHSP83蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 FeHSP83蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果Fig.4 Prediction of three-dimensional structure of FeHSP83 protein

2.3 FeHSP83基因的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖5)，經(jīng)干旱和鹽脅迫處理后，F(xiàn)eHSP83基因能較快響應(yīng)脅迫，且在根、葉不同部位的表達(dá)量存在較大差異。在干旱脅迫條件下，F(xiàn)eHSP83在植株根部的表達(dá)量持續(xù)上升，至48 h達(dá)到最大，響應(yīng)較為強(qiáng)烈；葉的表達(dá)量呈先升后降的狀態(tài)，在48 h時(shí)表達(dá)量最高，12 h時(shí)表達(dá)量較低。在鹽脅迫條件下，F(xiàn)eHSP83在植株葉部的響應(yīng)較為強(qiáng)烈，在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，之后開始下降；根部的表達(dá)量在3 h時(shí)迅速升高，隨后緩慢下降。

圖5 FeHSP83在甜蕎不同組織中的表達(dá)分析Fig.5 Relative expression analysis of FeHSP83 in different tissues of sweet buckwheat

3 討 論

熱激蛋白(HSPs)是一類在生物體受到外界脅迫時(shí)由轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)合成產(chǎn)生的高度保守的蛋白質(zhì)家族。目前，HSP被報(bào)道主要有三類生物學(xué)功能：(1)分子伴侶，能夠幫助其他的蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)，而自身不參與相關(guān)代謝；(2)獲得耐熱性；(3)調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[15]。HSP90作為HSP家族中的一員，分子量大約為90 KD，通常以同型二聚體結(jié)構(gòu)存在于真核細(xì)胞中，王彬等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CmHSP90基因參與了中國南瓜對逆境的應(yīng)答，表達(dá)量與其定位以及執(zhí)行的功能有一定關(guān)系。葉綠體HSP90主要參與光和熱激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而線粒體HSP90的功能較為特殊，主要作用為免受氧化脅迫帶來的傷害。此外，有研究顯示，熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)在逆境信號傳導(dǎo)過程中起著重要的作用，大量HSP家族基因表達(dá)受其調(diào)控。

甜蕎是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，其生育期短、適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)，在干旱地區(qū)作物布局中具有極其重要的地位。本研究根據(jù)已知序列進(jìn)行FeHSP83基因的引物設(shè)計(jì)，從甜蕎品種西農(nóng)9976中成功克隆了FeHSP83基因的編碼序列，在對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)FeHSP83基因具有HSP90家族所有的Pfam區(qū)域，在進(jìn)化關(guān)系上與藜麥FeHSP83蛋白、甜菜FeHSP83蛋白較為接近，與番茄FeHSP83蛋白相距較遠(yuǎn)，推測FeHSP83蛋白隸屬于HSP90家族，在功能上可能與藜麥較為相似，具有較高的同源保守性。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)了逆境脅迫條件下特異性表達(dá)基因FeHSP83，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在干旱和鹽脅迫條件下，F(xiàn)eHSP83基因在甜蕎幼苗子葉和根部的表達(dá)量顯著上升，且在根和葉不同部位間的反應(yīng)存在較大差異。在干旱脅迫處理下，甜蕎幼苗子葉和根部反應(yīng)迅速，子葉部分表達(dá)量相對較大，而在鹽脅迫條件下，甜蕎幼苗子葉和根部反應(yīng)較為遲緩，根部的表達(dá)量遠(yuǎn)高于子葉部分。因此，我們可以推測，F(xiàn)eHSP83基因參與了甜蕎對逆境脅迫的應(yīng)答，在甜蕎抗旱研究中起到一定作用。在后續(xù)的研究中，我們可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入蕎麥，進(jìn)一步探究FeHSP83基因在逆境脅迫下的調(diào)控機(jī)制，為蕎麥的抗逆分子育種奠定基礎(chǔ)。