李 鵬,馬 驪,徐 芳,劉麗君,姚彥林,蒲媛媛 王旺田,李學才,方 彥,孫萬倉,武軍艷

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

油菜作為我國四大油料作物之一，是繼水稻、小麥、玉米、大豆之后我國的第五大農(nóng)作物。最近幾年，雖然我國油菜的播種面積和產(chǎn)量均排在世界前列，但是國產(chǎn)的食用油脂依然比較少，在國內(nèi)消費市場僅占35%～40%，我國食用植物油的供給一直處于嚴重短缺的狀態(tài)[1-3]。我國北方地區(qū)冬季寒冷春季干旱，冬季氣溫在0℃以下，甚至有時候極端低溫[4]，低溫對油菜造成的傷害已經(jīng)逐漸成為了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的問題，因此對品種的抗寒性要求也越來越高。在北方地區(qū)能夠安全越冬的冬油菜類型主要是白菜型冬油菜，甘藍型冬油菜因為其越冬率太低而無法大面積推廣種植[5]。但甘藍型油菜具有抗倒伏、抗旱、產(chǎn)量高等優(yōu)勢，最近幾年，隨著強冬性甘藍型冬油菜品種的選育成功，其在北方冬油菜產(chǎn)區(qū)部分地區(qū)開始種植，但因為其抗寒性還是不如白菜型冬油菜[6]，遭遇極端低溫天氣時無法保證正常越冬，產(chǎn)量不穩(wěn)定，所以改良甘藍型冬油菜品種的抗寒性成為北方冬油菜產(chǎn)區(qū)重要的育種目標之一[7]。

在外界環(huán)境變化時葉片是最先感知的器官，同時又作為光合作用的主要場所，它的形態(tài)變化是植物適應環(huán)境的基礎[8]。在低溫脅迫下，植物直立生長相對于匍匐生長更容易受到低溫損傷，匍匐生長的油菜在生長過程中會隨溫度降低生長點逐漸下陷[9]，同時植株葉片開始卷曲皺縮，葉面積也開始逐漸減小[10]。低溫脅迫下，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化反應，致使各項生理指標發(fā)生變化，這些生理指標的變化在一定程度上可以反映植物抗寒性[11]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用主要是參與合成細胞內(nèi)的有機溶質(zhì)，這些有機溶質(zhì)中有許多有機小分子，包括脯氨酸(Pro)、甜菜堿、甘油等，還包括一些可溶性物質(zhì)，比如可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)等，在植物受到低溫的影響后，這些有機小分子能夠通過增加細胞的滲透勢來降低細胞的冰點，防止由于過度脫水而對細胞造成危害[12-17]。鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使，參與了植物對環(huán)境信號的應答反應。各種生物或非生物逆境包括病原菌侵染、干旱、鹽害、冷害、熱害等均能誘導植物細胞質(zhì)Ca2+濃度提高[18]。Ca2+通過維持應激狀態(tài)下的信號轉(zhuǎn)導和細胞結構穩(wěn)定性來減輕Na+的毒性作用[19]。K+在維持細胞質(zhì)中正負離子平衡、激活關鍵的酶促反應、維持液泡的滲透壓等方面發(fā)揮著重要作用[20]。前期研究結果表明，白菜型冬油菜的抗寒性強于甘藍型冬油菜品種，蒲媛媛等[7]、馬驪等[21]發(fā)現(xiàn)不同抗寒性白菜型冬油菜和甘藍型冬油菜在遭受低溫冷凍之后都會通過升高葉片中可溶性物質(zhì)來保護葉片細胞的膜結構，但增加量的多少又反映了白菜型與甘藍型冬油菜遭受冷害之后自身代謝的差異。

因此，本研究選擇強抗寒性白菜型油菜品種隴油6號和甘藍型油菜品種2019-QL-GAU-30，比較兩個不同類型強抗寒性品種在越冬前形態(tài)變化、光合特性和滲透調(diào)節(jié)特性，探尋不同類型冬油菜抗寒性機理的差異，為選育強抗寒性甘藍型冬油菜提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的甘藍型冬油菜品種2019-QL-GAU-30(2017—2020年多點平均越冬率83%)和白菜型冬油菜品種隴油6號(2017—2020年多點平均越冬率98%)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學油菜課題組提供，試驗地海拔2 150 m，103°40′ E， 36°03′ N，年平均氣溫6.5℃，平均降雨量175 mm。

1.2 試驗設計

試驗于2020年8—11月在甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)甘肅省油菜工程技術研究中心進行。小區(qū)面積4 m2，3次重復，隨機區(qū)組排列，試驗材料播種方式為點播，行距20 cm，株距10 cm，于五葉期開始取樣。具體取樣日期及取樣溫度見表1。(由于需要根據(jù)溫度的具體變化和油菜形態(tài)特征變化進行測定和取樣，故部分指標測定時間不一致)。

表1 取樣日期及對應氣溫表

1.3 試驗方法

1.3.1 冬油菜干物質(zhì)的測定 于越冬前不同溫度時期取樣，每次3個重復，測定干物質(zhì)的積累量。在盡可能不損失根系的情況下將植株完整挖出，用清水將植株沖洗干凈，從子葉節(jié)處切開分成地上部與地下部，用濾紙吸干表面水分，分別用烘箱進行烘干(105℃殺青40 min，85℃烘干至恒重)和電子天平稱重(精確度0.001 g，上海越平科學儀器有限公司)。分別計算植株地上部、地下部含水量和根冠比。

1.3.2 葉面積的測定 于10月18日、11月15日、11月22日每一個小區(qū)選擇有代表性的植株3株分別測定其長柄葉、短柄葉、無柄葉的最大寬和最大長并分別計算3種葉片的葉面積。葉面積(cm2)=長×寬×0.75[22]。

1.3.3 葉綠素SPAD值的測定 選取長勢相同的6株植株用葉綠素儀分別測定植株心葉、心外1葉、心外2葉、心外3葉、心外4葉、心外5葉的葉綠素SPAD值。

1.3.4 光合指標Pn、Gs、Tr和Ci的測定 測定日10∶00—12∶00采用GFS-3000光合儀(德國WALZ)，使用開放氣路，分別測定已標記的6株植株第3片功能葉的光合指標。

1.3.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定 采集3株植株展開的第3片葉和地下部，用于生理指標的測定。用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[23]；用磺基水楊酸法測定脯氨酸含量[23]；用蒽酮法測定可溶性糖含量[23];用硝酸消解、ICP-AES法測定鈉鉀鈣離子含量[24]，每個指標重復測3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021進行試驗數(shù)據(jù)的處理和圖表制作，采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 越冬前冬油菜形態(tài)變化

2.1.1 越冬前冬油菜地上部形態(tài)變化 分別在10月18日、11月15日和11月29日記錄了白菜型冬油菜隴油6號和甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30的形態(tài)特征變化，見圖1。10月18日兩種冬油菜都是直立或者半直立生長，葉色為綠色(圖1A和圖1B)。11月15日兩種冬油菜葉片匍匐在地面，葉片顏色變成深綠并帶有紫色，老葉變黃(圖1C和圖1D)。11月29日時，白菜型冬油菜葉片萎蔫，并完全匍匐于地面，老葉變黃、干枯；甘藍型冬油菜葉片萎蔫皺縮，匍匐于地面，葉色變深，老葉變黃干枯(圖1E和圖1F)，但是白菜型冬油菜隴油6號的黃化萎蔫程度大于甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30，這可能是白菜型冬油菜通過形態(tài)變化主動應對低溫，而甘藍型冬油菜是被動適應低溫的一個過程。

注：A 、C和E分別為2019-QL-GAU-30在10月18日、11月15日和11月29日形態(tài)特征。B、D和F分別為隴油6號在10月18日、11月15日和11月29日形態(tài)特征。Note: A, C, and E are the morphological characteristics of 2019-QL-GAU-30 on October 18, November 15, and November 29, respectively. B, D, and F are the pattern characteristics of Longyou 6 on October 18, November 15, and November 29, respectively.

2.1.2 越冬前冬油菜植株形態(tài)及其干、鮮質(zhì)量的變化 越冬前兩種冬油菜植株形態(tài)如圖2所示。隴油6號和2019-QL-GAU-30地下部分的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量都隨著溫度變化逐漸增大，但隴油6號大于2019-QL-GAU-30；2019-QL-GAU-30的地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量都大于隴油6號。這可能是由于越冬前白菜型冬油菜隴油6號主動應對低溫已經(jīng)開始向地下部儲存營養(yǎng)物質(zhì)來保證正常的越冬，而甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30被動應對低溫還是在進行正常的營養(yǎng)生長。

注：A、B分別為10月18日和11月1日隴油6號和2019-QL-GAU-30整株形態(tài)特征對比。Note: A and B are the comparison of the morphological characteristics of the whole plant of Longyou 6 and 2019-QL-GAU-30 on October 18 and November 1, respectively.

2.1.3 越冬前冬油菜根冠比和組織含水量的變化 由圖4可見，隴油6號和2019-QL-GAU-30的根冠比都逐漸增大，干物質(zhì)逐漸向地下部分積累，為越冬準備充分的營養(yǎng)物質(zhì)；隴油6號根冠比的增加量顯著高于2019-QL-GAU-30，這可能與二者抗寒方式的差異有關。葉片和根系的含水量都表現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但變化幅度較小，品種間差異不顯著。

2.1.4 越冬前冬油菜葉面積的變化 由圖5可見，隴油6號和2019-QL-GAU-30的長柄葉、短柄葉和無柄葉的葉面積均呈現(xiàn)出減小的趨勢，但變化不顯著。2019-QL-GAU-30的長柄葉葉面積下降幅度大于隴油6號，可能是因為溫度過低冬油菜營養(yǎng)生長受阻，葉片卷曲皺縮，阻礙了甘藍型冬油菜長柄葉葉面積的增加。

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Different letters indicate significance differences between treatments (P<0.05), the same below.

圖4 冬油菜根冠比和組織含水量的變化Fig.4 Changes in root-shoot ratio and tissue water content of winter rapeseed

圖5 冬油菜長柄葉、短柄葉和無柄葉葉面積的變化Fig.5 Changes in leaf area of long-stalked, short-stalked, and sessile leaves in winter rapeseed

2.2 越冬前降溫過程中冬油菜光合指標的變化

2.2.1 葉綠素SPAD值的變化 隴油6號心外1葉、心外2葉SPAD值表現(xiàn)為先增大后減小，而心外3葉、心外4葉和心外5葉變化不明顯。這可能因為溫度降低后合成葉綠素的酶活性降低導致葉綠素合成受阻。而甘藍型冬油菜所有葉片的SPAD值都逐漸增大，但差異不顯著，這可能是由于細胞脫水導致，這一結果與其形態(tài)變化相一致。

2.2.2 光合參數(shù)的變化 如圖6所示，隴油6號和2019-QL-GAU-30的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度都隨時間進程顯著下降，而胞間CO2濃度顯著上升，且隴油6號的氣孔導度、凈光合速率和蒸騰速率高于20119-QL-GAU-30，但差異不顯著，可能是因為低溫導致氣孔關閉，但隴油6號抗寒性較強，故氣孔開度大于2019-QL-GAU-30。

圖6 凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度和氣孔導度的變化Fig.6 Changes in Pn，Tr，Ci and Gs

2.3 越冬前冬油菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

2.3.1 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化 隴油6號和2019-QL-GAU-30葉片的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量均顯著上升，但隨著溫度逐漸降低其積累速度變緩。可溶性糖含量先升高后降低，11月1日達到最大值。葉片鈉離子含量的變化都呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢；而鉀離子和鈣離子含量的變化均為先上升后下降，且在10月25日達到最大值。

2.3.2 根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化 隴油6號和2019-QL-GAU-30根部的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量都表現(xiàn)為平緩上升的趨勢；而可溶性糖含量呈現(xiàn)出先下降然后上升的趨勢，且上升幅度較大。比較葉片和根部的可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量，發(fā)現(xiàn)這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在根部的含量均大于葉片，這可能因為冬油菜為了能夠正常越冬根部積累大量的營養(yǎng)物質(zhì)來保證越冬期間正常的營養(yǎng)供給。隨著氣溫的降低，白菜型冬油菜根部鈉離子含量逐漸升高，甘藍型冬油菜根部鈉離子含量先上升然后下降，在11月1日達到最大值。兩種冬油菜鉀離子和鈣離子的含量都是先降低然后升高，都在11月1日有最小值。與葉片離子含量相比，隴油6號根部Na+含量逐漸增加，這可能是低溫限制了氣孔的開度，降低了葉片的蒸騰速率，阻礙了Na+由根部向葉片的運輸，減小了Na+對葉片的毒害作用。而葉片Ca2+的含量遠大于根部，這可能是由于較高的Ca2+含量可以保證冬油菜正常的光合作用和增加細胞滲透勢，保證正常的生長發(fā)育。

2.4 越冬率與各指標間的相關性

相關性分析結果表明，越冬率與可溶性糖含量、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量和Ca2+含量(根)呈極顯著負相關(P<0.001)；越冬率與根冠比和根干質(zhì)量呈極顯著正相關(P<0.001)，與根鮮質(zhì)量和Ca2+含量(葉)呈顯著正相關(P<0.05)。表明葉片大量的營養(yǎng)物質(zhì)向根部運輸，根部通過積累營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運來增加冬油菜的抗寒性，以適應低溫環(huán)境。

表2 葉片葉綠素SPAD值的變化

圖7 冬油菜葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化Fig.7 Changes in leaf osmotic adjustment substances of winter rapeseed

圖8 冬油菜根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化Fig.8 Changes in osmotic adjustment substances in the roots of winter rapeseed

3 討 論

3.1 低溫脅迫對冬油菜形態(tài)特征的影響

由于北方地區(qū)冬季寒冷干燥，冬油菜更容易受到凍害的影響，其中越冬前是油菜最易發(fā)生凍害的3個關鍵時期之一。油菜植株的葉片、根部也是容易遭受凍害的主要部位，當油菜植株對溫度敏感的部位受到凍害時，會導致葉片干枯萎蔫、爛根、死苗等，嚴重影響其營養(yǎng)生長及生殖生長[25]。在越冬前為了適應低溫，冬油菜葉片形態(tài)發(fā)生變化，植株呈半直立或者匍匐生長，葉色深綠，稍微帶一點紫色或紅色。本研究中，隨著溫度的逐漸降低，兩種不同類型冬油菜都能通過增大根冠比、降低組織含水量、降低葉面積來保證正常的越冬，營養(yǎng)物質(zhì)向根部運輸，根部積累大量有機物，導致根冠比增加。白菜型冬油菜隴油6號的根系直徑、根冠比均顯著大于甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30，含水量小于2019-QL-GAU-30，可見根系、根冠比是白菜型冬油菜越冬抗寒性強的重要形態(tài)特征。這與蒲媛媛等[7]、馬驪等[21]、武軍艷等[26]研究結果一致。因此，選育根系粗、根冠比大的材料，對提高其越冬抗寒性可能更有利 。

注：*，**，***分別表示在P<0.05,P<0.01,P<0.001水平差異顯著。紅色表示正相關性，藍色表示負相關性；顏色深淺表示相關性系數(shù)值的大小，顏色越深，相關性越強。Note: *, ** and *** indicate significant differences at the level of P<0.05，P<0.01 and P<0.001, respectively. Red indicates positive correlation, blue indicates negative correlation; the depth of color indicates the magnitude of the correlation coefficient value, the darker the color, the stronger the correlation.

3.2 低溫脅迫對冬油菜光合特性的影響

光合作用是多數(shù)植物受冷脅迫影響最明顯的過程之一[27-28]，氣孔導度控制著葉片的蒸騰能力[29]，氣孔導度下降導致胞間CO2供應不足，因光合原料的缺乏，凈光合速率的降低使光合產(chǎn)物的積累量減小[30]。本研究表明，隨著溫度的降低，兩種不同類型冬油菜凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度都有不同程度的下降，而胞間CO2濃度增大，這可能是冬油菜通過調(diào)整氣孔的開閉狀態(tài)來適應低溫，這與朱惠霞等[31]研究結果一致。光合指標的變化與植株自身的形態(tài)特性也密不可分，遭受低溫脅迫后，兩種不同類型冬油菜光合速率都降低，白菜型冬油菜隴油6號地上部分營養(yǎng)物質(zhì)開始向地下部運輸，而甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30還在進行正常的營養(yǎng)生長。由于隴油6號地上部分向地下部運輸?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)多，導致隴油6號的根冠比和根干質(zhì)量大于2019-QL-GAU-30，更有利于保證正常的越冬。因此推斷強抗寒性冬油菜通過調(diào)節(jié)光合特性來影響其營養(yǎng)物質(zhì)的輸送、儲存方式，進一步影響其生長發(fā)育特性。

3.3 低溫脅迫對冬油菜滲透調(diào)節(jié)的影響

低溫造成植物傷害的最初部位是細胞膜的損傷[32]，植物感受低溫和其他脅迫后在體內(nèi)合成大量的保護性物質(zhì)來調(diào)節(jié)生理生化變化，使細胞滲透勢保持平衡來維持細胞膜的穩(wěn)定性[33-34]。研究表明可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸的含量累積與抗寒性呈顯著的正相關關系[35-36]，本研究結果顯示除葉片可溶性糖含量表現(xiàn)出先增加后減小之外，葉片和根部的其他可溶性物質(zhì)均增加，這與蒲媛媛[7]、馬驪[21]等研究結果一致，表明冬油菜通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來調(diào)節(jié)細胞滲透勢，使細胞質(zhì)的濃度升高，防止細胞內(nèi)結冰，保證植株正常生長，但白菜型冬油菜隴油6號根部的可溶性物質(zhì)含量均高于甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30，說明隴油6號通過將營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)礁浚黾痈诒群透睆奖ＷC安全越冬。通過兩種冬油菜的對比，白菜型冬油菜隴油6號的葉片鈣離子含量遠大于甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30，且根部鈉離子含量大于葉片，推測冬油菜為了抵御低溫，通過增加葉片鈣離子含量保證冬油菜正常的光合作用和維持細胞內(nèi)滲透壓穩(wěn)定，通過減少鈉離子的含量、降低鈉離子的毒害作用來維持冬油菜正常的生長發(fā)育。

4 結 論

本研究結果表明在越冬前遭受冷脅迫后白菜型冬油菜隴油6號的根冠比、累積的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、葉片積累鈣離子含量、氣孔導度和凈光合速率都大于甘藍型冬油菜2019-QL-GAU-30，而葉片鈉離子的含量和胞間CO2濃度小于2019-QL-GAU-30，由此可見較大的根冠比、較高的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、鈣離子含量和凈光合速率可有效提高冬油菜的抗寒性，可為選育抗寒性強的甘藍型冬油菜提供一定的理論依據(jù)。