(1.榆林市第五醫(yī)院,陜西 榆林 719000;2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安 712046；3.中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院，河北 保定 071000)

茜草為茜草科植物茜草(RubiacordifoliaLinn.)的干燥根及根莖，我國常用大宗中藥材，歷版藥典均有收載[1]。茜草性苦、寒，歸肝經，生用或炒碳用，具有涼血，祛瘀，止血，通經等功效，主產于陜西、河南等地，系陜西省“秦藥”品種的大宗道地藥材之一[2-3]?，F代研究表明，茜草中的主要化學成分有蒽醌類、總酚類、總黃酮類、多糖類、萜類及大量微量元素等，其中酚類成分具有顯著的生理活性，藥理學研究表明茜草總酚類成分茜草素在體外對大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌和變形桿菌等都具有明顯的抑制作用[4-10]。然而，目前缺乏關于茜草總酚提取工藝的優(yōu)化研究。響應曲面法(response surface methodoloy,RSM)是將實驗影響因素與實驗結果(響應值)的相互影響關系進行多項式擬合，把因素和實驗結果關系通過函數化的曲面展示出來的統計法[11-12]。近年來，響應曲面法已被廣泛的運用于中草藥相關活性成分提取工藝的優(yōu)化研究，且取得了一定的研究進展[13-18]，遂將此法用于茜草的提取工藝中。本實驗以中藥材茜草為原料，在單因素試驗基礎上，結合Box-Behnken響應面法進行茜草總酚的提取工藝優(yōu)化，通過多項式擬合出最佳提取工藝參數，并對其進行試驗驗證，以期獲得茜草中總酚超聲提取的最佳產率，為茜草這一“秦藥”資源的進一步開發(fā)利用提供支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV-2450型紫外分光光度計(日本島津公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；KQ-200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS-02型多功能高速粉碎機(上海兆申科技有限公司)；FA2104型電子分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

1.2試藥 茜草藥材采集于陜西省銅川市王益區(qū)，經陜西中醫(yī)藥大學胡本祥教授鑒定為茜草科茜草屬植物茜草RubiacordifoliaLinn.的干燥根及根莖。藥材樣品經蒸餾水清洗干凈后，60 ℃烘干，粉碎過70目篩，置于真空干燥器備用。無水乙醇、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉(均為分析純，購自于天津市天利化學試劑有限公司)、福林酚試劑(山東西亞化學工業(yè)有限公司)；水為蒸餾水。

2 方法

2.1總酚含量測定

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品12.40 mg，加蒸餾水定容至10 mL，制成濃度為1.24 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液，4 ℃保存。

2.1.2標準曲線的繪制 分別精密吸取沒食子酸對照品溶液0，100，200，300，400，500，600，700，800 μL置于帶有刻度的10 mL透明離心管中，依次加入蒸餾水稀釋至4 mL，再加入1 mL的福林酚試劑，最后加蒸餾水使成8 mL，搖勻，在754 nm測吸光度。以濃度(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。沒食子酸濃度0～0.124 mg·mL-1濃度范圍內，線性良好，回歸方程為Y=14.447X+0.0212，r=0.9992。

2.1.3供試溶液的制備及樣品測定 精密稱取茜草藥材粉末0.2000 g，置于50 mL規(guī)格錐形瓶內，按照單因素試驗及響應面試驗設計方案進行提取，制備供試溶液，重復三次。精密吸取儲備液1 mL，同2.1.2項下的方法操作，測定吸光度，代入工作曲線，計算得率(mg·g-1)。

2.2單因素實驗 料液比考察了1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，提取時間考察了30,40,50,60,70,80 min，乙醇體積分數考察了40%、50%、60%、70%、80%、90%，提取溫度考察了30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，提取功率考察了100 W、125 W、150 W、175 W、200 W、225 W，提取次數考察了1,2,3,4,5,6次。

2.3響應面優(yōu)化工藝條件 在單因素實驗研究的基礎上，確定提取次數2次，提取功率200 W的前提下，采用統計分析軟件Design-Expert 12，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，選擇乙醇體積分數(A)、料液比(B)、提取時間(C)3個因素作為考察因素，以茜草總酚得率(Y)為評價指標，設計3因素3水平試驗，因素水平及編碼見表1。

表1 因素水平表

3 結果

3.1單因素試驗 由圖1可知，茜草總酚提取得率隨著超聲次數到達2次后趨于平緩；乙醇體積分數對茜草總酚得率影響較大，當體積分數為80%時得率最高(10.20 mg·g-1)；隨著料液比的增加，茜草總酚提取得率升高，在料液比為1∶30時得率最高(9.58 mg·g-1)，隨后料液比增加但得率下降；茜草總酚提取得率隨提取時間先增加后降低，在提取時間為60 min時得率最高(10.15 mg·g-1)；茜草總酚提取得率隨提取溫度的升高先增加后降低，當溫度達到70 ℃時，得率最高(10.07 mg·g-1)；在100 W～225 W范圍內，茜草總酚提取得率呈緩慢上升趨勢，當超聲功率為200 W時得率最高(9.78 mg·g-1)，達到225 W時，得率反而降低。

圖1 不同提取因素對茜草總酚提取率的影響

3.2Box-Behnken響應面法

3.2.1建立模型方程 應用Design-Expert 12軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到茜草中總酚得率(Y)的回歸方程為：

Y=9.42+0.36A-1.00B+0.17C-0.067AB+

0.079AC+0.058BC-0.25A2-0.31B2-

0.06C2

表2 響應面法設計與結果

3.2.2回歸方差分析 對擬和回歸方程進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型的F值為11.9300，P=0.0018<0.05，差異顯著，建立的回歸模型準確。失擬項F值為0.1235，P=0.9415>0.05，誤差小，方程擬合度較好，建立的模型可用于試驗結果的分析預測。對茜草總酚提取得率影響顯著的因素是A，極顯著的因素是B?；贔值的大小，影響總酚提取得率因素排序為：料液比>乙醇體積分數>提取時間；交互作用中乙醇體積分數和提取時間影響最大，料液比和提取時間則最小，見圖2。

表3 方差分析

A.乙醇體積分數；B.料液比；C.提取時間

3.2.3最佳提取工藝及驗證 基于模型分析，得到茜草總酚最佳提取工藝為：料液比為1∶30.63，乙醇體積分數73.53%，提取時間為63.91 min，提取溫度為68.94 ℃，總酚得率預測值為10.54 mg·g-1。結合實踐，將工藝修正為：料液比為1∶30，乙醇體積分數75%，提取時間為65 min?；谏鲜鰲l件進行5次平行驗證，茜草總酚得率平均值為(10.48±0.16)mg·g-1，接近預測值，表明建立的模型可靠，基于響應面法輔助超聲可用于茜草總酚提取工藝優(yōu)化。

4 討論

茜草主要含有蒽醌類、黃酮類、酚酸類和多糖等多種化學成分，具有調節(jié)血脂和膽固醇、降血壓、利尿等多種藥理作用[19-20]。目前，茜草的活性成分研究多集中于蒽醌類成分的化學、質量評價及藥理活性等方面，關于總酚的報道較少[21-22]。料液比、提取溶劑體積分數、提取時間、溫度、次數、功率均能夠影響中藥材中活性部位的得率[23-24]。對于茜草中總酚而言，只有在合適的提取工藝下才能增加得率。因此，本實驗在單因素考察的基礎上，采用響應曲面法考察了料液比，乙醇體積分數和提取時間對茜草總酚得率的影響，結果證實三個因素的綜合作用可顯著影響總酚得率。通過對所有數據模型和實驗結果進行分析，獲得了茜草總酚的最佳超聲提取工藝為，料液比1∶30，乙醇體積分數75%，提取時間65 min，提取次數2次，超聲功率200 W。

響應曲面進行工藝參數優(yōu)化具有顯著的優(yōu)勢，在多因素綜合分析、數據處理的基礎上，可獲得模型及回歸方程，已成功應用于多種中藥材的有效成分、有效部位等提取工藝的優(yōu)化[25]。經工藝驗證實驗表明，本研究構建的茜草總酚最佳提取工藝切實可行，操作簡單，提取得率高，可為茜草總酚的開發(fā)利用提供基礎支持。