戴芷晴,姚心怡,徐小媛,焦旭穎,管金山，王月飛

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

帕金森病是一種主要表現(xiàn)為進(jìn)行性錐體外系功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩和共濟(jì)失調(diào)等運(yùn)動癥狀，和嗅覺減退、睡眠障礙、認(rèn)知功能障礙或自主神經(jīng)功能障礙等非運(yùn)動癥狀[1-2]。帕金森病以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性丟失為主要特征，線粒體損傷是這一結(jié)果的主要成因[3-4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路可通過抗氧化及調(diào)控自噬的方式參與機(jī)體線粒體保護(hù)。有研究證實(shí)，激活或過表達(dá)AMPK，能夠減輕魚藤酮致帕金森病大鼠的多巴胺能神經(jīng)元損傷，AMPK參與了帕金森病的病情進(jìn)展[5]。枸杞多糖是枸杞的主要功效成分，其能自由通過并調(diào)節(jié)血腦屏障，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性，且無毒副作用[6]。既往有研究證明，枸杞多糖能夠通過激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt通路保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[7]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察枸杞多糖對魚藤酮致帕金森病大鼠神經(jīng)元及AMPK-mTOR通路的影響，進(jìn)一步探討了枸杞多糖保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠45只，體重約250 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)2020-0001。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021196)。

1.2藥物與試劑 魚藤酮晶體(Rhawn公司，批號：RH239743)，枸杞多糖粉末(西安圣青生物科技有限公司，批號：SQGQ201910012)，二甲基亞砜(Bio Froxx公司，批號：EZ2921C395)，辛酸/癸酸甘油三酯(MIGLYOL 812N，上海信守助劑有限公司，批號：20201207)；AMPK酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號：202105481)、磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號：202105236)、mTOR酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號：202105269)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號：202105509)、線粒體氧化呼吸酶Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號：202105387)均購于廈門惠嘉生物科技股份有限公司。

1.3主要儀器 離心機(jī)(Thermo)；酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS)；洗板機(jī)(Thermo Labsystems)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏)；電子天平(Sartorius)；體視顯微鏡(MOTIC)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分為對照組、帕金森病組及枸杞多糖組，每組15只。枸杞多糖組給予枸杞多糖50 mL/kg灌胃預(yù)處理，帕金森病組及對照組給予等量蒸餾水灌胃預(yù)處理，均1次/d，持續(xù)3 d。預(yù)處理結(jié)束后，帕金森病組及枸杞多糖組參考文獻(xiàn)[8]方法，于頸背部皮下注射魚藤酮(2 mg/kg溶解于二甲基亞砜及MIGLYOL 812N中，比例為1∶50)造模，對照組注射等量等比不含魚藤酮的二甲基亞砜及MIGLYOL 812N混合溶液。注射3 h后，枸杞多糖組給予枸杞多糖水溶液50 mg/kg灌胃，對照組及帕金森病組給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)過程中由于進(jìn)食障礙，帕金森病組大鼠死亡4只。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)。

1.5.2腦黑質(zhì)電鏡下病理觀察 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取2只大鼠，禁食12 h后用15%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，麻醉后快速斷頭取腦，體視顯微鏡下分離黑質(zhì)，置于2.5%戊二醛中固定，送至齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理中心進(jìn)行后續(xù)處理，之后在透射電鏡下觀察、照相。

1.5.3紋狀體線粒體氧化呼吸酶Ⅰ及AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白含量 取每組剩余大鼠，禁食12 h后用15%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，麻醉后快速斷頭取腦，在冰面上迅速分離雙側(cè)紋狀體置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中冷凍儲存。用勻漿器將采集到的紋狀體標(biāo)本制成15%的組織勻漿，以3 000 r/min離心20 min取上清液，按照試劑盒使用說明檢測AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR含量，計算p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值。

2 結(jié) 果

2.1大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 造模7 d后，帕金森病組大鼠首先出現(xiàn)相關(guān)行為異常，表現(xiàn)為體重減輕、毛色發(fā)黃雜亂、精神狀態(tài)不佳，同時出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、偏側(cè)旋轉(zhuǎn)及靜止性震顫等癥狀。隨著造模時間延長，帕金森病組大鼠癥狀持續(xù)加重,并出現(xiàn)偶發(fā)緩慢旋轉(zhuǎn)、軀體僵直及口鼻出血；枸杞多糖組大鼠也出現(xiàn)相關(guān)癥狀，但對比帕金森病組，癥狀更輕；對照組大鼠未出現(xiàn)明顯的行為異常。至28 d造模結(jié)束時,帕金森病組4只大鼠因嚴(yán)重進(jìn)食障礙死亡，枸杞多糖組和對照組無大鼠死亡。

2.2大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡下顯示，對照組大鼠線粒體形態(tài)正常；帕金森病組大鼠黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體廣泛腫脹變性，部分線粒體發(fā)生空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹以及脫顆粒；枸杞多糖組大鼠神經(jīng)元線粒體僅發(fā)生可逆性的輕度水腫，溶酶體增多。見圖1。

圖1 對照組及帕金森病各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(TEM，×20 000)

2.3大鼠紋狀體線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量及AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白比值比較 與對照組比較，帕金森病組大鼠紋狀體線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量明顯升高(P<0.05)，p-AMPK/AMPK比值明顯降低(P<0.05)；與帕金森病組比較，枸杞多糖組大鼠紋狀體線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量明顯降低(P<0.05)，p-AMPK/AMPK比值明顯升高(P均<0.05)；3組p-mTOR/mTOR比值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 對照組及帕金森病各組大鼠紋狀體氧化呼吸酶Ⅰ含量和AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白比值比較

3 討 論

神經(jīng)細(xì)胞能量儲存較少而需求極高。線粒體電子傳輸鏈(ETC)作為氧化呼吸、產(chǎn)生ATP的重要環(huán)節(jié)，其異常將導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)明顯功能損傷，最終嚴(yán)重影響神經(jīng)細(xì)胞的正常生命活動。ETC在氧化呼吸過程中產(chǎn)生氧化呼吸副產(chǎn)物，即活性氧(ROS)。通常情況下，ROS可在抗氧化劑的作用下最終被轉(zhuǎn)化為無毒的水[9]。ETC中任何環(huán)節(jié)受抑制均會引起供能異常、線粒體破壞，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生而無法清除[10]。當(dāng)ROS異常蓄積至超出機(jī)體清除能力時，氧化應(yīng)激將被啟動[11]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，自由基將攻擊多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致蛋白錯誤折疊并蓄積[12]，而錯誤折疊的α-突觸核蛋白與其他蛋白共同形成的路易小體是帕金森病的病理特征之一。另外高濃度的ROS是細(xì)胞自噬的激活因素[13]，自噬是一種細(xì)胞自食現(xiàn)象，在此現(xiàn)象中，細(xì)胞形成包含聚集蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、大分子復(fù)合物等物質(zhì)的雙膜自噬體，與溶酶體融合后，發(fā)揮降解細(xì)胞內(nèi)成分作用[14]。生理情況下，機(jī)體可以通過自噬功能選擇性地去除異常蛋白和受損線粒體，防止線粒體ROS聚集導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；自噬功能異常會導(dǎo)致異常蛋白堆積，引起神經(jīng)元損傷。

既往研究證實(shí)，魚藤酮可以抑制神經(jīng)細(xì)胞中作為ETC起始端的線粒體氧化呼吸酶Ⅰ，可有效建立帕金森病大鼠模型[15]。線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量的升高提示ETC異常，進(jìn)而提示線粒體破壞，神經(jīng)元受損，故通過測定線粒體氧化呼吸酶Ⅰ的含量可反映魚藤酮建模效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，帕金森病組大鼠黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體腫脹變性，部分線粒體發(fā)生空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹以及脫顆粒，線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量明顯升高；枸杞多糖組大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷較輕，溶酶體增多，線粒體氧化呼吸酶Ⅰ含量明顯降低。提示枸杞多糖通過抑制氧化應(yīng)激及激活細(xì)胞自噬起到減輕多巴胺能神經(jīng)元損傷、減緩帕金森病進(jìn)程的功效。

AMPK是細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器，其廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在維持神經(jīng)元的活性和功能中起著至關(guān)重要的作用。mTOR是PI3K蛋白激酶類家族成員，是自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[16]?；罨膍TOR可通過影響mTORC1復(fù)合體的形成，使 mAtg13和ULK1高度磷酸化，從而抑制細(xì)胞自噬[17]。AMPK能磷酸化mTOR使其轉(zhuǎn)換為失活的p-mTOR，從而解除mTOR對自噬的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白及活性氧簇的清除，減少異常蛋白蓄積及氧化應(yīng)激對神經(jīng)元線粒體的毒性作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，帕金森病組大鼠紋狀體中p-AMPK/AMPK比值明顯降低，枸杞多糖組大鼠紋狀體中p-AMPK/AMPK比值明顯升高，3組p-mTOR/mTOR比值變化不明顯。提示AMPK-mTOR通路可能與帕金森病細(xì)胞自噬及氧化應(yīng)激調(diào)控存在聯(lián)系，枸杞多糖抗氧化及調(diào)控細(xì)胞自噬的作用可能基于AMPK-mTOR通路。

綜上所述，枸杞多糖可能通過 AMPK-mTOR信號通路，抑制氧化應(yīng)激及調(diào)控細(xì)胞自噬，起到保護(hù)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的作用。本研究為臨床應(yīng)用枸杞多糖防治帕金森病提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。