唐睿漪，鐘源，葛賢秀，張春梅，朱漢龍，劉嘉寧，繆林

膽道梗阻(obstruction of biliary tract，OBT)為膽道急腹癥患者中的死亡率相對(duì)較高的另一個(gè)常見(jiàn)病癥，導(dǎo)致了膽管的堵塞，膽汁郁積，并且容易繼發(fā)感染。導(dǎo)致急性膽道梗阻發(fā)生的器質(zhì)性病變可大致上分為以下二種，即為良性的病變與為惡性疾病。良性膽道病變中以原發(fā)性膽道結(jié)石黃疸為臨床最為常見(jiàn)，其次才是慢性膽管的炎癥性的狹窄癥(如十二指腸乳頭狹窄、急慢性膽管炎等)黃疸，膽道的良性腫瘤黃疸(如膽總管囊腫等)黃疸，一些膽道良性疾病黃疸癥的反復(fù)發(fā)生，其最明顯的黃疸伴隨的表現(xiàn)癥狀是左上腹有隱痛，發(fā)寒發(fā)熱，腹部性質(zhì)通常為脹痛絞疼為重，有時(shí)候絞疼為明顯表現(xiàn)，既往有多次多次發(fā)作的病史，通常發(fā)病呈急性或亞急性[1]。惡性膽道阻塞(malignant biliary obstruction，MBO)是由于惡性腫瘤的擠壓或直接轉(zhuǎn)移造成膽管狹窄，膽汁排泄受阻，其惡性疾病常見(jiàn)的病因包括膽管癌、肝門(mén)內(nèi)段膽管癌、肝門(mén)部膽管癌、胰頭占位性的病變、壺盂腹癌變及其他一些不常見(jiàn)原因所致的肝膽管及其旁系組織上的癌腫、其他癌腫導(dǎo)致的膽管周?chē)[大淋巴結(jié)壓迫單管等。有研究表明，由于膽汁排泄障礙，引起腸道菌群轉(zhuǎn)移，繼而引起病毒感染進(jìn)而發(fā)生膿毒血癥而危及生存[2-3]。了解膽道梗阻患者菌群分布特點(diǎn)及良惡性病變的差異有助于提高術(shù)前抗感染水平，降低術(shù)后并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，改善患者術(shù)后生命質(zhì)量。本文通過(guò)前瞻性研究，收集了膽管梗阻患者的膽汁樣本，對(duì)初發(fā)、復(fù)發(fā)與惡性膽道梗阻患者膽汁進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，分析其菌群組成差異性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年3月至2018年11月因膽道梗阻行ERCP手術(shù)的36例患者，將其分成三組:A組為15例首次行ERCP手術(shù)的膽道良性梗阻病人，年齡段47～91歲，男8例，女7例;B組為13例良性膽道梗阻復(fù)發(fā)行ERCP手術(shù)的病人，年齡段67～92歲，男7例，女6例;C組為8例因惡性膽道梗阻行ERCP手術(shù)的病人，年齡55～87歲，男6例，女2例。三組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～92歲；②膽道梗阻并成功施行ERCP的患者；③自愿參加研究，由患者或家屬簽訂知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①ERCP時(shí)有全身感染跡象的患者；②伴隨心、肺、腎等功能障礙、其他惡性腫瘤的患者；③孕婦等特殊人群；④根據(jù)指南需術(shù)前使用抗生素者；⑤一周內(nèi)因任何原因接受光譜抗生素治療的患者。

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 樣品采集流程

對(duì)入組的病人在ERCP術(shù)前與其談話(huà)，取得患者及其家屬同意。進(jìn)行治療性ERCP時(shí)，十二指腸鏡插鏡到十二指腸乳頭，經(jīng)乳頭插管至膽總管，灌注造影劑前，利用無(wú)菌灌注器抽出6～7 mL膽汁，密封后-80 ℃冰箱分裝保存。以上過(guò)程均執(zhí)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序

取得DNA樣品后，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)[4]；檢驗(yàn)合格的樣本建立文庫(kù):回收目的擴(kuò)增子片斷，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷產(chǎn)生的粘性部分恢復(fù)成平末端，再透過(guò)3′端加堿基“A”，可使DNA片斷能與3′端具有“T”堿基的特異接頭相連;或者設(shè)計(jì)組合具有測(cè)序鏈接頭的雙Index融合引物，以基因組DNA為模版，經(jīng)過(guò)融入引物PCR，磁珠檢測(cè)目的擴(kuò)增子切片，最后一步用合格的文庫(kù)完成cluster復(fù)制和測(cè)序。

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，剩余高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)(clean data)方可用于后期分析；通過(guò)數(shù)據(jù)之間的疊加關(guān)系將數(shù)據(jù)連接成Tags；在給定的類(lèi)同度下將Tags聚成OTU( Operational Taxonomic Units)，然后通過(guò)OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋?zhuān)總€(gè)OTU被認(rèn)為代表不同的微生物物種[5]；根據(jù)OTU和物種注釋結(jié)果開(kāi)展樣本種類(lèi)復(fù)雜性數(shù)據(jù)分析及其組間種類(lèi)差異性數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本技術(shù)研究的測(cè)序和生物學(xué)信息由華大基因股份有限公司負(fù)責(zé)。

1.5.1 OTU分布情況

拼接的Tags經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，全部樣本選擇樣本中最小的Tags條數(shù)，在97%相似度下將其聚合為用作生物類(lèi)別的OTU，計(jì)算各個(gè)樣本在各個(gè)OTU中的豐度數(shù)據(jù)信息。各組之間的OUT數(shù)量也不同，Venn圖用于統(tǒng)計(jì)組間差異OTUs的交并集情況[6]，不考慮OUT豐度，只考慮OUT有無(wú)。

1.5.2 物種累積曲線(xiàn)分析

物種累積曲線(xiàn)(species accumulation curves)常用于表述不斷增大取樣量后種類(lèi)增長(zhǎng)趨勢(shì)的情形。該曲線(xiàn)的含義是指，隨著樣品量的增多，OTU數(shù)量不斷增多，曲線(xiàn)逐漸趨于平緩，表明腸道菌群的數(shù)量已達(dá)到平衡，即使再加大樣品量，菌群的種類(lèi)及數(shù)量也不會(huì)有變化[7]。如果曲線(xiàn)反而越來(lái)越陡峭，這就表明目前的樣本量還不夠，OTU 數(shù)量太少，所以需要再加大樣本量。

1.5.3 PCA分析

主成分分析(PCA)是一種將多元數(shù)據(jù)集線(xiàn)性轉(zhuǎn)換為一組不相關(guān)變量的方法，按解釋的方差降序排列。通過(guò)這種方法，我們可以解釋前幾個(gè)常常解釋大量變異的成分，來(lái)確定相似要求的樣本組合是不是存在相似性[8]。

1.5.4 PLS-DA分析

偏最小二乘判別分析(Partial least squares Discriminant Analysis， PLS-DA)可以構(gòu)建體內(nèi)代謝物表達(dá)量與樣本類(lèi)型相互之間的關(guān)系模型，來(lái)進(jìn)行對(duì)樣本類(lèi)型的估計(jì)。

1.5.5 α多樣性分析

α多樣性(Alpha diversity)主要用于分析樣本內(nèi)部的物種組成群落多樣性[9]。型圖可以直觀反映三組樣品菌群組成多樣性的最大值、最小值、中位數(shù)及離散程度。根據(jù)未經(jīng)過(guò)濾的OTU計(jì)數(shù)，計(jì)算每組的阿爾法多樣性指數(shù)包括:測(cè)序深度指數(shù)、豐度-覆蓋率估計(jì)器(ACE)、Chao1、Shannon、Simpson。測(cè)序深度指數(shù)包括觀察到的物種(observed Species)和物品覆蓋(Good′s coverage):觀測(cè)到的生物指標(biāo)代表該樣本中包含的生物總量，數(shù)值越高說(shuō)明樣本生物富集度越高[10]，ACE和Chao1指數(shù)用于評(píng)估組間富集度的差異，而Simpson和Shannon指數(shù)用于衡量均勻度。從一組樣品統(tǒng)計(jì)中隨意取二個(gè)OTU，它們歸屬于不同物種的幾率，這一幾率越大代表樣品的生物復(fù)雜性越高，反之越低，該指標(biāo)用于評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)種在群落中的地位和作用。運(yùn)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對(duì)三組患者膽汁菌群之間的差異進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.6 β多樣性分析

為了評(píng)估Beta多樣性，我們使用Bray-Curtis距離，Unweighted Unifrac距離和weighted UniFrac距離測(cè)度方法分析評(píng)估[11]。Unifrac 分析得到的距離矩陣可用于多種分析方法，可通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法PCoA 分析，直觀顯示不同環(huán)境樣品中微生物進(jìn)化上的相似性及差異性[12]。PCoA(principal co-ordinates analysis)是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過(guò)PCoA 可以觀測(cè)個(gè)體或群體間的差異[13]。β-多樣性在0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.7 LEfse分析

LEfse(LDA Effect Size)分析方法，能夠完成多種分類(lèi)之間的對(duì)比，還通過(guò)分類(lèi)對(duì)比的內(nèi)部進(jìn)行亞組比較分析方法，進(jìn)而找出各組間在豐度上有明顯差別的物種。LDA 分?jǐn)?shù)絕對(duì)值≥2.0被認(rèn)為是顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 物種組成和豐度差異

2.1.1 OTU分布情況分析

如圖1所示，A組有473個(gè)OTU，B組有258個(gè)OTU，A組與B組交叉181個(gè)；C組有491個(gè)OTU，與A組交叉261個(gè)。花瓣圖可顯示各樣本間共有和特有的OTUs，從花瓣圖可知，36例患者共有OTU個(gè)數(shù)為2。

圖1 OUT Venn圖及花瓣圖

2.1.2 物種累積曲線(xiàn)分析

圖2為本次研究中三組膽道梗阻患者的膽汁的物種累積曲線(xiàn)圖，從中可以看出，隨著樣本量不斷增加，曲線(xiàn)逐漸平緩，樣本中包含的菌群種類(lèi)及數(shù)量也趨于平衡，這表明選取的樣本量是合格的，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖2 物種累積曲線(xiàn)

2.1.3 PCA分析

基于OTUs水平，得到36例樣品的PCA分析結(jié)果(圖3)，良性初發(fā)組與良性復(fù)發(fā)組比較PC1貢獻(xiàn)值為31.8%，PC2貢獻(xiàn)值為23.13%(圖3A)，良性初發(fā)組與惡性組比較PC1貢獻(xiàn)值29.34%，PC2貢獻(xiàn)值20.54%(圖3B)，三組一起比較可見(jiàn)PC1貢獻(xiàn)值為30.34%，PC2貢獻(xiàn)值為20.91%(圖3C)，這說(shuō)明三組樣品在菌群組成差異性上沒(méi)有很好的區(qū)分開(kāi)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)差別不顯著。

2.1.4 PLS-DA分析

基于OTUs水平，得到36例樣品的PLS-DA分析結(jié)果(圖4)。可以發(fā)現(xiàn)良性復(fù)發(fā)組包含在了良性初發(fā)組和惡性組里，但是良性初發(fā)組和惡性組的差異較大。

2.2 樣品復(fù)雜度分析

2.2.1 α多樣性分析

如圖5所示，惡性膽管梗阻組的患者對(duì)比兩組良性膽管梗阻患者的菌群，在觀察到的物種指數(shù)分析、Chao1指數(shù)分析、ace指數(shù)分析和Shannon指數(shù)上明顯升高(P<0.05)，而Simpson指數(shù)明顯降低，在物品覆蓋分析指數(shù)上無(wú)明顯差異(P>0.05)。但良性初發(fā)和良性復(fù)發(fā)膽管梗阻患者的菌群無(wú)明顯差異。這表明惡性膽管患者膽汁中菌群的豐度和多樣性明顯高于良性患者，膽汁菌群的組成收到了惡性腫瘤的影響，而復(fù)發(fā)的患者膽汁菌群的豐度和多樣性無(wú)明顯改變。

圖3 主要成分分析圖 A:良性初發(fā)組與良性復(fù)發(fā)組的PCA分析;B：良性初發(fā)組與惡性組的PCA分析;C：良性初發(fā)組、良性復(fù)發(fā)組與惡性組的PCA分析

圖4 PLS-DA分析

2.1.2 β多樣性分析

如圖6所示，三組樣本基于Bray-Curtis距離的PCoA第一主成分、第二主成分與第三主成分分別30.93%、19.94%與14.41%，如圖7、8所示基于Unweighted UniFrac、weighted UniFrac的三種主成分分別為18.28%、9.27%、7.18%和42.50%、25.91%、9.27%。我們發(fā)現(xiàn)這些樣品沒(méi)有明顯的分離趨勢(shì)，通過(guò)β多樣性分析，表明這三個(gè)群體的物種組成沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.1.3 LEfse分析

LDA評(píng)分絕對(duì)值≥2.0時(shí)，兩組良性組間有15個(gè)種之間存在明顯差別，其中10個(gè)富集于良性初發(fā)組，即氏菌屬(Roseburia)、代爾夫特菌(Delftia)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、副球菌屬(Paracoccus)、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、黃單胞菌目(Xanthomonadales )，紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)有5個(gè)富集于良性復(fù)發(fā)組，即互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)、Pyramidobacter、Dethiosulfovibrionaceae、Synergistia、Synergistates。惡性組間有13個(gè)種之間存在顯著差異，即鏈球菌屬(Streptococcus)、Stretococcaceae、Pyramidobacter、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)、Synergiatia、Dethiosulfovibrionaceae、Synergistales、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、(假單胞菌)Pseudomonas、Weeksellaceae、Flavobacteriia、Flavobacteriales、Chryseobactrium。

圖5 α多樣性分析箱型圖 A：觀察到的物種指數(shù)分析；B:Chao1指數(shù)分析；C:ACE分析；D:Shannon指數(shù)分析；E:Simpson指數(shù)分析；F:物品覆蓋分析

圖6 Bray-Curtis距離 A:A組和B組的Bray-Curtis距離；B:A組和C組的Bray-Curtis距離；C:B組和C組的Bray-Curtis距離

圖7 Unweighted UniFrac距離 A組和B組的 Unweighted UniFrac距離；B:A組和C組的 Unweighted UniFrac距離；C:B組和C組的 Unweighted UniFrac距離

圖8 Weighted UniFrac距離 A組和B組的Weighted UniFrac距離；B:A組和C組的 Weighted UniFrac距離；C:B組和C組的Weighted UniFrac距離

圖9 LEfse分析 A：良性組間的差異種;B：惡性組間的差異種

3 討論

膽管梗阻是十分常見(jiàn)的肝膽疾病，導(dǎo)致的一般類(lèi)型可分成良性膽管梗阻和惡性膽管梗阻，導(dǎo)致良性膽管梗阻的一般病因有膽道結(jié)石、膽管炎性狹窄和先天生膽道生長(zhǎng)發(fā)育異常等，而惡性膽管梗阻臨床診斷上也極為普遍，導(dǎo)致的病因多是中晚期惡性腫瘤，一般包含膽管細(xì)胞癌、壺腹部腫瘤、膽囊癌、肝細(xì)胞肝癌、胰腺癌和胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及子宮癌等轉(zhuǎn)移或侵犯膽管[14]。目前認(rèn)為結(jié)石的復(fù)發(fā)與結(jié)石大小、體脂指數(shù)、結(jié)石成分有關(guān)[15]，但現(xiàn)階段關(guān)于菌群組成對(duì)復(fù)發(fā)性膽道疾病的影響報(bào)道少之又少。在人體健康的情況下膽道和膽汁都是無(wú)菌的[16]，而有些膽系病變患兒的膽汁病菌培育結(jié)果顯示卻為陽(yáng)性，且國(guó)外尸檢報(bào)道患有膽系病變患者中膽囊壁細(xì)菌檢出約占23%，膽汁樣品中監(jiān)測(cè)到的菌株占8%左右[17]。通常狀況下肝細(xì)胞分泌膽汁的最高排出壓是30 cm H2O，而且無(wú)膽汁反流，患者不會(huì)出現(xiàn)感染癥狀。而膽在膽道梗阻時(shí)，膽汁反流的壓力會(huì)升高，最大分泌壓為20 cm H2O，會(huì)出現(xiàn)膽汁分泌被抑制和引流不暢，膽汁會(huì)逆流入血液，加重患者的感染癥狀，而且腫瘤患者免疫力低下導(dǎo)致條件致病菌入侵、胃腸功能紊亂和膽鹽缺乏影響膽汁的肝腸循環(huán)，這些因素都會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，致病菌經(jīng)小腸移位至十二指腸增加膽系感染的幾率[18]。大量研究表明，惡性膽管梗阻常見(jiàn)的致病菌分別是大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、腸桿菌屬和腸球菌屬，良性膽管梗阻的主要致病菌分別是大腸埃希桿菌、腸球菌屬、銅綠假單胞菌等，膽系感染的細(xì)菌和腸道菌群存在著一致性，表明膽系感染多為腸源性感染[19]。膽總管下部開(kāi)放于十二指腸大乳頭，當(dāng)病人出現(xiàn)膽道梗阻時(shí)，膽總管擴(kuò)張，肝胰壺腹括約肌功能收到損害，小腸病菌逆行入侵膽總管定植和增殖，導(dǎo)致膽總管內(nèi)菌群失調(diào)[20,21]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，基于細(xì)菌16SrDNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)已成為細(xì)菌群落和物種鑒定的首選方法，成本較低，數(shù)據(jù)庫(kù)更新迭代。越來(lái)越多的證據(jù)表明，疾病不是由病原體單獨(dú)決定的，而是由病原體、常駐微生物群和宿主免疫反應(yīng)之間的復(fù)雜平衡決定的。本研究采用16srDNA技術(shù)對(duì)良性初發(fā)組、良性復(fù)發(fā)組和惡性組膽道梗阻的患者的膽汁標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，初步探討三組間的差異。良性初發(fā)組有473個(gè)OTU，良性復(fù)發(fā)組有258個(gè)OTU ，惡性組有491個(gè)OTU。從OTU的積累曲線(xiàn)和稀釋曲線(xiàn)來(lái)看，隨著樣本量的增加，曲線(xiàn)逐漸變平，樣本菌群的OTU趨于穩(wěn)定，說(shuō)明36例的樣本量足夠，測(cè)量數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度基本達(dá)到。通過(guò)多角度比較膽道微生物區(qū)系，阿爾法多樣性分析表明，惡性膽道梗阻的患者膽汁微生物區(qū)系豐度增加，而兩組良性患者膽汁菌群多樣性差異不顯著。各組間PCoA和Beta差異分析顯示，良惡性膽管梗阻的患者膽汁細(xì)菌組成無(wú)顯著差異。這些結(jié)果說(shuō)明惡性膽道梗阻患者膽管內(nèi)微生物種類(lèi)較多，但良惡性膽管梗阻的患者個(gè)體沒(méi)有明顯變化。在組間，三組差異最大的分別為氏菌屬、互養(yǎng)菌門(mén)和鏈球菌屬。以上提示膽道梗阻患者ERCP后膽道菌群的變化不一定與復(fù)發(fā)性膽道梗阻相關(guān)，但對(duì)惡性膽道梗阻的形成有一定的影響。