梁曉艷 趙 夢 陳 超 周 洋 李斌斌 趙紫琦 顧 玉

1.承德護理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，河北承德 067000；2.河北省承德市中心醫(yī)院檢驗科，河北承德 067000

缺血性腦血管疾病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率等特點，挽救腦缺血后瀕死神經(jīng)元，改善缺血所致的神經(jīng)功能障礙為醫(yī)學(xué)界的一大難題。近年來，隨著對成年神經(jīng)系統(tǒng)再生能力和干細胞的研究逐步深入，運用神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）治療ICVD 成為臨床研究熱點。研究證實，成年哺乳動物（包括成人）腦內(nèi)的NSC 絕大多數(shù)處于相對靜止的狀態(tài)，當(dāng)腦缺血或其他腦損傷時，可誘導(dǎo)其增生、定向遷移并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。然而，腦缺血后NSC何時開始增生、增生高峰期、持續(xù)時間及分化結(jié)局等仍有待進一步研究。巢蛋白（neuro epithelial stem cell prote，Nestin）是NSC 最常用的標志物，可在一定程度上反映NSC 的變化，其短暫表達于胚胎發(fā)育早期的NSC，腦缺血損傷后成年腦組織又能重新大量表達。為了能更有效地運用內(nèi)源性NSC 來促進腦缺血后神經(jīng)功能的修復(fù)，研究腦缺血后NSC 的具體反應(yīng)至關(guān)重要。因此，本研究通過采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察腦缺血大鼠腦內(nèi)Nestin 的表達變化，旨在探討腦缺血后NSC 的增生、遷移和分化規(guī)律，為臨床上運用內(nèi)源性NSC 來治療ICVD 患者提供一定實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 成年健康SD 雄性大鼠77 只（成都達碩生物科技有限公司），實驗動物合格證號：SCXK（川）2008-24，體質(zhì)量（260±20）g，其中2只大鼠用于腦缺血后2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC），余75 只采用隨機數(shù)字法隨機分為正常對照組（Control）、假手術(shù)組（Sham）和缺血組（大腦中動脈閉塞middle cerebral artery occlusion，MCAO）；假手術(shù)組和缺血組又分為術(shù)后1d、2d、3d、1 周、2 周、3 周和4 周共7個亞組，每組5 只。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審（審批號：D·WLL20220007001），實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準。

1.1.2 主要試劑和儀器 TTC 染色、兔抗GFAP 抗體、Cy3 標記的羊抗鼠IgG、FITC 標記的羊抗兔IgG（美國Sigma Chemical 公司）；鼠抗Nestin 抗體（美國Santa cruz 公司）；S-P 即用型超敏試劑盒、DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠永久性腦缺血模型復(fù)制 參照肖宗宇等的MCAO 模型復(fù)制方法，利用顯微外科技術(shù)在右側(cè)顳骨前下緊鄰顴弓前份上緣的部位開窗入顱，電凝阻斷嗅束至大腦下靜脈間的一段大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA），從而相應(yīng)部位產(chǎn)生永久性腦缺血。假手術(shù)組僅暴露MCA 但不凝閉，余步驟相同。

1.2.2 MCAO模型大鼠腦組織TTC染色 將2 只用于腦TTC 染色的大鼠于MCAO 術(shù)后1d 斷頭取腦，將其中1 只大鼠腦組織經(jīng)-20℃冰箱凍存20min，去除嗅球、小腦和低位腦干后沿冠狀面切成5 片，同另1只完整的大鼠腦組織一起浸入1%TTC 溶液，于37℃的水浴箱中避光染色30min，期間每10min 翻動一次腦片，使其染色均勻，取出腦組織浸入2%多聚甲醛充分固定后照相分析。

1.2.3 免疫組化樣品制備及染色 各組大鼠按相應(yīng)時間點灌注固定、斷頭取腦，常規(guī)制作石蠟切片，厚度10μm。①抗Nestin 抗體的免疫組化（stre-ptavidinperoxidaseconjugtate method,SP）法單標染色下試劑說明書操作，一抗為小鼠抗大鼠 Nestin 抗體（1∶500）。②抗Nestin/GFAP 抗體的免疫熒光雙標染色步驟：切片脫蠟至水，微波爐高火15min 完成抗原修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑及5%非免疫性羊血清，置室溫15min，甩去血清加一抗（鼠抗Nestin 抗體，1∶500；兔抗GFAP 抗體，1∶1000），4℃冰箱過夜后，加Cy3（紅色熒光）標記的羊抗鼠IgG 和FITC（綠色熒光）標記的羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育1h，以上每一步驟后均用0.01mol/L 的PBS緩沖液沖洗3 次，每次3min，熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果。陰性對照組分別用PBS 緩沖液和羊血清代替一抗，其余步驟同上。

1.2.4 免疫組化結(jié)果 每只大鼠隨機挑選相同部位的4 張切片，在顯微鏡下分別于雙側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）、大腦皮質(zhì)和紋狀體選取3 個高倍視野（×400），對各腦區(qū)的Nestin陽性細胞拍照并計數(shù)，采用Image Pro Plus 6.0 圖文分析系統(tǒng)測量平均吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TTC 染色結(jié)果

大鼠腦缺血后1d，腦組織TTC 染色顯示，非部位染為紅色，梗死灶呈蒼白色，梗死灶與大腦中動脈供血區(qū)相吻合，梗死范圍和體積恒定，全腦和腦組織冠狀切片TTC 染色均證明模型復(fù)制成功，見圖1。

圖1 腦缺血后1d 腦組織TTC 染色

2.2 抗Nestin 抗體免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 腦缺血后Nestin 陽性產(chǎn)物的分布規(guī)律 Nestin免疫陽性產(chǎn)物呈棕褐色，定位于胞質(zhì)和突起，陰性對照未著色。正常對照組和假手術(shù)組，Nestin 陽性產(chǎn)物主要分布于雙側(cè)SVZ 和第三腦室周圍，大腦皮質(zhì)和紋狀體僅少量血管內(nèi)皮呈Nestin 弱陽性；腦缺血后，Nestin 陽性細胞從缺血側(cè)SVZ 梯度式遷往梗死灶邊緣，隨著缺血時間延長及梗死體積逐漸縮小，陽性細胞始終緊緊圍繞在梗死灶的邊緣，但未能進入梗死灶中央，梗死灶中央只見少量纖維狀結(jié)構(gòu)和血管內(nèi)皮呈Nestin 陽性，見圖2。

圖2 腦缺血后Nestin 陽性產(chǎn)物的分布規(guī)律（×40，抗Nestin 抗體免疫組化染色）

2.2.2 腦缺血后Nestin 陽性細胞的形態(tài)變化 正常對照組和假手術(shù)組，大腦皮質(zhì)和紋狀體未見Nestin 陽性細胞，分布于SVZ 和第三腦室周圍的Nestin 陽性細胞呈橢圓形或不規(guī)則形，體積小，突起短少。腦缺血后，Nestin 陽性細胞呈多突起的星形，突起呈放射狀從胞體發(fā)出，形似星形膠質(zhì)細胞，隨著缺血時間延長，陽性細胞體積逐漸變大，突起增多、變長；同時，從缺血側(cè)SVZ 至梗死灶，Nestin 陽性細胞呈現(xiàn)出定向遷移的形態(tài)，距梗死灶越近的細胞體積越大、突起越長，且大部分突起伸向梗死灶，見圖3。

圖3 腦缺血后Nestin 陽性細胞的形態(tài)變化（×400，抗Nestin 抗體免疫組化染色）

2.2.3 腦缺血后Nestin 陽性細胞的數(shù)量變化 正常對照組和假手術(shù)組相比較，以及假手術(shù)組各亞組之間比較，分布于各腦區(qū)的Nestin 陽性細胞數(shù)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；腦缺血后，Nestin陽性細胞數(shù)呈一過性增多，于缺血后3d 達到高峰。與正常對照組、假手術(shù)組和缺血對側(cè)比較，缺血側(cè)SVZ 的Nestin 陽性細胞數(shù)于缺血后1d、2d、3d、1周，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；腦缺血后1d，梗死灶周圍大腦皮質(zhì)和紋狀體出現(xiàn)Nestin 陽性細胞，并持續(xù)存在至缺血后4 周；缺血后1d、2d、3d、1周，缺血對側(cè)大腦皮質(zhì)和紋狀體也出現(xiàn)少量Nestin陽性細胞，見表1。

表1 MCAO 后各組大鼠的Nestin 陽性細胞數(shù)（，個，n=5）

2.2.4 腦缺血后Nestin 陽性細胞的平均吸光度值 與正常對照組、假手術(shù)組和缺血對側(cè)比較，缺血側(cè)SVZ的Nestin 陽性細胞平均吸光度值于缺血后1d、2d、3d 和1 周，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），其中，缺血后3d 達高峰，缺血后2 周已回落到正常水平，見圖4；缺血側(cè)大腦皮質(zhì)和紋狀體的Nestin 陽性細胞平均吸光度值于MCAO 后各組均升高，高峰期在缺血后3d 和1 周，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），見圖5。

圖4 MCAO 后各組大鼠SVZ 的Nestin 陽性細胞平均吸光度值的變化

圖5 MCAO 后各組大鼠大腦皮質(zhì)和紋狀體Nestin陽性細胞平均吸光度值的變化

2.3 Nestin/GFAP 免疫熒光雙標染色結(jié)果

正常對照組和假手術(shù)組，大腦皮質(zhì)和紋狀體可見少量血管內(nèi)皮有微弱的Nestin 陽性表達，有大量GFAP 陽性細胞散在分布，免疫熒光雙標未見Nestin與GFAP 有共表達；腦缺血后，梗死灶周圍大腦皮質(zhì)和紋狀體的Nestin 陽性細胞和GFAP 陽性細胞均增多，且大部分Nestin 陽性細胞與GFAP 共表達，見圖6。

圖6 腦缺血后1 周梗死灶周圍大腦皮質(zhì)和紋狀體Nestin/GFAP 免疫熒光雙標染色

3 討論

神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSCs）是指具有自我更新和增生能力，且能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的細胞群。目前已證實，成年哺乳動物（包括成年人）腦內(nèi)多個部位存在NSC，其中側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）被公認為成年腦內(nèi)最大的“神經(jīng)干細胞庫”。生理情況下，分布于SVZ 部位的NSC 持續(xù)增生、更新，經(jīng)吻側(cè)遷移流向嗅球遷移，在遷移過程中NSC不斷發(fā)育成熟，最終分化為嗅球的中間神經(jīng)元。然而，腦缺血等損傷后，在某些細胞因子或信號通路的作用下，SVZ 顯著增生的NSC 逐漸遷往梗死灶方向，并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，通過替換死亡神經(jīng)元、挽救瀕死神經(jīng)元及抑制炎癥反應(yīng)等，參與腦缺血后神經(jīng)功能的重建。Xu 等運用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血2h 再灌注模型，實驗表明梗死灶周圍的Nestin 陽性細胞于缺血后1d 開始增多，缺血后7d 陽性細胞數(shù)量達到高峰，陽性細胞可持續(xù)存在至缺血后2 周。王佳等從大面積腦梗死患者術(shù)后廢棄的前顳葉腦組織中成功分離出NSC，通過體外培養(yǎng)其能夠大量增生、穩(wěn)定傳代并維持NSC 特性，且具有向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞分化的潛能。以上研究均表明，通過激活內(nèi)源性NSC 來修復(fù)腦缺血患者神經(jīng)功能障礙具有十分重要的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血損傷后，缺血側(cè)SVZ部位的Nestin 陽性細胞被激活，并遷往梗死灶周圍的大腦皮質(zhì)和紋狀體，于缺血后3d 陽性細胞計數(shù)最多，該結(jié)果與部分研究認為Nestin 陽性細胞在缺血后7d 數(shù)量最多不一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)，隨著缺血時間的延長，增生的Nestin 陽性細胞逐漸減少直至消失，缺血后2 周，缺血側(cè)SVZ 的陽性細胞數(shù)及表達強度已回落到正常水平，梗死灶周圍的陽性細胞在缺血后4 周也基本消失，推測可能是由于絕大部分新生細胞因缺血區(qū)的新陳代謝、氧化、炎癥及其他刺激引發(fā)的凋亡機制而死亡。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一種細胞，其特異性標志物為膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）常用于星形膠質(zhì)細胞的鑒定和分離。星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元起支持、營養(yǎng)及協(xié)助代謝等作用，對維持神經(jīng)元的正常形態(tài)和功能至關(guān)重要。腦缺血損傷后，星形膠質(zhì)細胞通過聚集于梗死灶邊緣形成膠質(zhì)瘢痕，起到限制缺血損傷范圍、避免梗死灶中央炎癥向外擴散的作用。另外，星形膠質(zhì)細胞還可以釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和免疫介質(zhì)，為缺血后神經(jīng)元的存活提供良好的微環(huán)境，加強神經(jīng)元抵御神經(jīng)毒性物質(zhì)的能力，減輕或阻止神經(jīng)元的繼發(fā)損傷，從而參與腦缺血組織的神經(jīng)功能修復(fù)。本實驗運用抗Nestin/GFAP 抗體的免疫熒光雙標染色發(fā)現(xiàn)，腦缺血后增生的絕大部分Nestin 陽性細胞與GFAP 有共表達，結(jié)合腦缺血后Nestin 的動態(tài)表達變化，推測腦缺血后增生的Nestin 陽性細胞由缺血側(cè)SVZ 逐漸遷移至梗死灶邊緣，并分化為星形膠質(zhì)細胞，從而參與腦缺血損傷后的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，腦缺血后激活了缺血側(cè)SVZ 部位的Nestin 陽性細胞一過性增生，于腦缺血后3d 達到增生高峰，Nestin 陽性細胞從缺血側(cè)SVZ 遷往梗死灶邊緣并分化為星形膠質(zhì)細胞，可能通過形成膠質(zhì)瘢痕、釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和免疫介質(zhì)等對腦缺血后神經(jīng)功能的修復(fù)起著重要作用。