王雅如，趙丹，楊翼航，楊凱迪，韓子薈，張旭

（晉中信息學(xué)院，山西晉中 030800）

大腸桿菌是一種很常見的革蘭氏陰性菌，大量存在于環(huán)境中、寄生于動物的腸道中，分為共生菌株和致病性菌株[1]。宿主健康狀態(tài)下一般不會致病，如果菌群失衡受到致病性菌株感染或者寄主的免疫力下降則有可能會引發(fā)腹瀉、膽囊炎、腹膜炎、肋膜炎等疾病甚至死亡[2]。金黃色葡萄球菌是一種很常見的革蘭氏陽性菌，也是極為常見的致病菌之一，可引發(fā)局部化膿、肺炎、膿毒癥等疾病[3]。由于抗生素的濫用使很多致病菌的耐藥性越來越強，在嚴(yán)重威脅人和動物的健康，加大防治難度。本實驗選取的射干、金銀花、黃連等中草藥是自然界常見的植物，含有可以有效抑菌的成分，且具有靶位多、廣譜性、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。因此，本實驗通過水煎法和醇提法兩種方式獲得的中草藥提取物研究其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌（菌株編號為：ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（菌株編號為：ATCC29213），美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；五倍子、烏梅、車前草、金銀花、射干、蒼耳子、黃連、白芷、薄荷與白術(shù)，山西老曙光藥店。

1.2 試劑與儀器

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基，杭州百思生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、無水乙醇和甲醇，分析純，天津市北辰方正試劑廠。

BSA224S型電子分析天平，德國Sartorius公司；JXFB-0電熱鼓風(fēng)干燥箱，蘇州巨興烘箱設(shè)備有限公司；DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZQZY-AF8振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；YM30立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；KDC-140HR型離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 水煎法提取中草藥的有效成分

將藥材放進粉碎機打成粉末后稱取20 g，加入150 mL去離子水浸泡24～30 h，強火煮沸后改為文火煎煮30 min，用4層紗布過濾，濾液放入4 ℃冰箱冷藏保存；濾渣加入150 mL去離子水浸泡30 min，強火煮沸后改為文火煎煮30 min，4層紗布過濾，合并濾液。7 000 r/min離心5 min去除藥液中殘留的藥粉，95 ℃蒸發(fā)濃縮后120 ℃、15 min高溫高壓滅菌，并用無菌水定容至20 mL，使藥液濃度為1 g/mL，放入4 ℃冰箱中冷藏備用[4]。

1.4 醇提法提取中草藥的有效成分

將藥材放進粉碎機打成粉末后稱取20 g，加入150 mL的95%乙醇，20 ℃、120 r/min振蕩，4天后用濾紙過濾，濾液在7 000 r/min下離心5 min去除殘留藥物粉末，55 ℃蒸發(fā)去除乙醇，并用酸性重鉻酸鉀檢驗，以確保徹底去除乙醇，最后用無菌甲醇定容至20 mL，使藥液濃度為1 g/mL，放入4 ℃冰箱中冷藏備用[5-6]。

1.5 菌液的制備

將活化好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)挑取單個菌落至10 mL的LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋ㄏ喈?dāng)于5×107～ 5×108cfu/mL），即為供試菌液[4,7]。

1.6 藥敏紙片的制備

將直徑為6 mm的圓形空白藥敏紙片放進藥物提取液中浸泡40 min，在超凈工作臺中烘干備用。

1.7 抑菌試驗

吸取100 μL的1.5項下所制菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，室溫干燥5 min。用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在平皿表面，每個平皿貼2片1.6項下制備的藥敏紙片（同種藥材的醇提取物和水提取物各1片）、1片含10 μg慶大霉素的藥敏紙片作為陽性對照、1片用無菌水處理過的紙片作為陰性對照，做3組平行試驗。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺以不同方向測量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)并取平均值[8-9]。抑菌圈小于10 mm表示有輕度抑菌作用，記錄為“+”；抑菌圈直徑10～15 mm表示有中度抑菌作用，記錄為“++”；15 mm以上表示有高度抑菌作用，記錄為“+++”[10]。

1.8 二倍試管稀釋法測定MIC

每種藥液準(zhǔn)備12支無菌1.5 mL無菌離心管，依次編號，分別加入500 μL的LB肉湯培養(yǎng)基。在1號管中加入500 μL的中藥提取原液，混合均勻；從1號管中取500 μL放入2號管中，混合均勻后取500 μL放入3號管中，重復(fù)操作至從9號管吸取500 μL到10號管，10號管混勻后棄去500 μL，然后向各管中加入5 μL菌液。11號管中加入500 μL的LB培養(yǎng)基、5 μL菌液和500 μL無菌水，作為陽性對照；12號離心管中加入500 μL的LB培養(yǎng)基、500 μL藥液和5 μL無菌水，作為陰性對照；重復(fù)3組。37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，較為清澈透明的管中菌含量較少，進行平板涂布培養(yǎng)，根據(jù)平板上菌落生長情況來判斷抑菌效果，在抑菌效果顯著的平板中其最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）[4]。

1.9 24孔板法測定MBC

在MIC試驗基礎(chǔ)上，取較高于MIC的藥液于24孔板中，每孔中放置不同濃度的藥液并加入20 μL菌液，做3組平行試驗，同時設(shè)置陰性對照組和陽性對照組，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，臺盼藍(lán)染色鏡檢，無活菌的孔中所對應(yīng)的藥液濃度中的最低藥物濃度為最小殺菌濃度（MBC）[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取物對大腸桿菌的抑制效果

表1展示了各種中草藥的醇提取物和水提取物對大腸桿菌的抑制效果，除了薄荷的醇提取物外其余中草藥提取物均對大腸桿菌有抑制作用，其中車前草、金銀花、射干和紫花地丁的水提取物效果明顯優(yōu)于其醇提取物；五倍子、烏梅、黃連、白芷、薄荷和白術(shù)的醇提取效果優(yōu)于其水提取物；五倍子、金銀花、紫花地丁、黃連與白芷的兩種提取物抑菌效果差異較大；對大腸桿菌抑制效果較好的3種提取物為五倍子的醇提取物、烏梅的水提取物和醇提取物。

表1 藥材醇提取物和水提取物對大腸桿菌的抑菌效果

2.2 中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果

表2展示了各種中草藥的醇提取物和水提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果，所有中草藥提取物對金黃色葡萄球菌均有抑制作用。其中，五倍子、車前草、金銀花、黃連、薄荷和白術(shù)的水提取物效果明顯優(yōu)于醇提取物；烏梅、射干、紫花地丁和白芷的醇提取效果明顯優(yōu)于其水提取物；烏梅和黃連的兩種提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用均明顯優(yōu)于其他中草藥提取物。

表2 藥材醇提取物和水提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果

2.3 討論

同種中草藥采取不同提取方式的提取液對同一菌種的抑菌效果不同，可能是不同提取方式和溶劑所提取出的抑菌有效成分不同。具體包括3個方面：（1）有效抑菌物質(zhì)在不同溶劑中溶解度不同；（2）兩種提取方式的提取溫度不同，水煎法溫較高，可能會使部分有效抑菌物質(zhì)變性；（3）提取的時間不同，可能導(dǎo)致所提取到的物質(zhì)有差異。

同種中草藥的同種提取液對不同菌種的抑菌效果不同，可能與提取液中成分對不同菌種的作用機理不同有關(guān)。目前對于中草藥抑菌作用的機理研究較少，已知的主要抑菌途徑有4方面：（1）干擾菌體的正常新陳代謝，破壞其酶活系統(tǒng)；（2）使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，影響菌體生長及繁殖；（3）改變細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)維持生命的代謝物質(zhì)外流或有害物質(zhì)內(nèi)流從而導(dǎo)致細(xì)胞失活；（4）抑制或破壞菌體生物被膜的形成[12]。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，可通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進入胞內(nèi)作用的物質(zhì)不同，從而表現(xiàn)出抑菌效果的差異。

3 結(jié)論

綜上，烏梅的醇提取物和水提取物對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有高度抑菌作用，可初步判斷其廣譜性較好；五倍子、金銀花、紫花地丁、白芷和黃連的兩種提取物對同一種菌的抑菌效果差異較大；同一種提取方式得到的五倍子、黃連、白術(shù)提取物對不同菌的抑菌效果差異較大。