徐焰平

（泉州醫(yī)學高等?？茖W校，福建泉州 362000）

隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性的問題日益突出，尋找新的抗菌物質(zhì)是當前相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的主要任務(wù)之一，而從具有抑菌作用的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中篩選是其中一個重要途徑[1-2]。課題組前期從仿生栽培鐵皮石斛中分離到一株具有抑菌功能的內(nèi)生真菌QZQM08，其代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用[3]。為了更好研究代謝產(chǎn)物抑菌效果，通過開展內(nèi)生真菌QZQM08培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，找到適合該菌生長的最適培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件，以期為篩選抑菌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

內(nèi)生真菌QZQM08：分離自福建泉州仿生栽培鐵皮石斛，接種于PDA斜面培養(yǎng)基，低溫（4 ℃）保存于泉州醫(yī)學高等?？茖W校健康學院醫(yī)學檢驗實訓室。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切片，加水1 L煮沸15 min，紗布過濾后再加20 g葡萄糖，加水補足至1 L[4]。

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基：將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為20 g蔗糖，其他參數(shù)不變。

馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、3‰孟加拉紅100 mL，定容至1 L。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，定容至1 L[5]。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨20 g，定容至1 L[6]。

1.1.3 儀器設(shè)備

BSC-1500ⅡA-X生物安全柜，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；Eclipse E200數(shù)碼顯微鏡，日本Nikon公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；KYC-100B恒溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海合恒儀器設(shè)備有限公司；TDZ4-WS臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.1.4 試劑

葡萄糖、蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、麥芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、脲、硝酸鉀和硝酸銨，分析純，廣州市西隴化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉，生化試劑（BR），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

采用PDA培養(yǎng)基，將內(nèi)生真菌QZQM08放置于培養(yǎng)箱28 ℃活化培養(yǎng)5 d，用滅菌的雙蒸水沖洗真菌菌落表面孢子，配制成濃度為0.5×106～1.0×106個/mL的孢子溶液以備后續(xù)實驗使用[7]。

1.2.1 不同液體培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

在250 mL錐形瓶中分別裝入50 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基，分別接種1 mL孢子溶液。將錐形瓶放置于28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)6 d[8]。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管，8 000 r/min離心10 min，倒掉上層培養(yǎng)液后60 ℃烘干至恒重，稱量菌絲干重。每種培養(yǎng)基設(shè)置5個重復。

1.2.2 不同培養(yǎng)溫度對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將內(nèi)生真菌QZQM08分別置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃和45 ℃培養(yǎng)，其他條件同1.2.1，每個溫度設(shè)置5 個重復[9]。

1.2.3 不同pH對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將內(nèi)生真菌QZQM08分別接種于pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0的培養(yǎng)基，放置于恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，其他條件同1.2.1，每個pH設(shè)置5個重復[10]。

1.2.4 不同接種量對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種內(nèi)生真菌QZQM08孢子液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，每個接種量設(shè)置5個重復，其他培養(yǎng)條件同1.2.1[11]。

1.2.5 不同碳源對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以20 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖和可溶性淀粉作為碳源，每一種碳源設(shè)置5個重復，其他培養(yǎng)條件同1.2.1[12-13]。

1.2.6 不同氮源對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、脲、硝酸鉀和硝酸銨作為氮源，每一種氮源設(shè)置5個重復，其他培養(yǎng)條件同1.2.1[14-15]。

1.2.7 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，在影響較大的接種量、pH、碳源（葡萄糖）和氮源（酵母浸粉）4個因素中篩選出比較適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長的3個水平，進行4因素3水平的正交試驗（見表1），其他培養(yǎng)條件同1.2.1[16]。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用IBM SPSS Statistics 26進行Duncan's多重比較分析，結(jié)果以均值±標準差的格式表示，P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

內(nèi)生真菌QZQM08在所選的5種培養(yǎng)基上均能生長，但是生長速度有明顯的不同。從表2中還可以發(fā)現(xiàn)，不同液體培養(yǎng)基上內(nèi)生真菌QZQM08的菌絲產(chǎn)量不同，按照菌絲產(chǎn)量排序為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基＞沙氏培養(yǎng)基＞馬丁氏培養(yǎng)基＞馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基＞察氏培養(yǎng)基，說明內(nèi)生真菌QZQM08最適合在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中生長。

表2 液體培養(yǎng)基類型對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.2 不同培養(yǎng)溫度對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

如表3所示，內(nèi)生真菌QZQM08在20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃均能生長，在45 ℃菌絲幾乎不生長；在28 ℃條件下內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量最大，說明內(nèi)生真菌QZQM08最適合在28 ℃進行培養(yǎng)。

表3 培養(yǎng)溫度對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.3 不同pH對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

如表4所示，內(nèi)生真菌QZQM08在所選pH供試培養(yǎng)基中均能生長，在pH為5.0、5.5和6.0的培養(yǎng)基中生長較好，培養(yǎng)基pH=5.5時菌絲產(chǎn)量最大，說明pH=5.5最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲的生長。

表4 pH對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.4 不同接種量對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

如表5所示，接種量對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響不顯著，當接種量為0.5 mL時已基本滿足培養(yǎng)要求，當接種量為1.0 mL時菌絲產(chǎn)量最大，說明較適合菌絲的生長，因此本研究其他單因素實驗的接種量均為1.0 mL。

表5 不同接種量對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.5 不同碳源對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

如表6所示，內(nèi)生真菌QZQM08在添加所選碳源的培養(yǎng)基中均能生長，但是菌絲產(chǎn)量有明顯的差異，碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中菌絲產(chǎn)量最大，說明葡萄糖最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長。

表6 碳源類型對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.6 不同氮源對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

如表7所示，內(nèi)生真菌QZQM08在添加所選氮源的培養(yǎng)基中均能生長，但是菌絲產(chǎn)量有明顯的差異，氮源為酵母浸粉的培養(yǎng)基中菌絲產(chǎn)量最大，說明酵母浸粉最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長。

表7 氮源類型對內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

2.7 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，當培養(yǎng)溫度為28℃內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量最大，以接種量、pH、碳源和氮源4個因素中篩選出比較適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長的3個水平，進行4因素3水平的正交試驗，見表8。試驗得出組合2培養(yǎng)出的菌絲產(chǎn)量最大，得出菌株最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基成分碳源為20 g/L葡萄糖、氮源為10 g/L酵母浸粉，接種量為1 mL，pH為6.0。

表8 正交試驗方案及其結(jié)果

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，仿生栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌QZQM08在液體馬鈴薯培養(yǎng)基中生長良好。菌絲的產(chǎn)量與接種量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件有關(guān)，最佳液體培養(yǎng)基為在馬鈴薯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母浸粉，接種量為1 mL，pH為6.0，培養(yǎng)溫度為28 ℃。