吳連連，胡安康

（徐州醫(yī)科大學(xué) 實驗動物中心，江蘇徐州 221004）

IGF-1是一種促生長因子，參與調(diào)節(jié)脊椎動物的體細(xì)胞生長和多種代謝過程，在維持機體結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用[1-2]，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，抑制炎癥等[3-4]。IGF-1也是心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要調(diào)節(jié)因子，研究證明其能有效改善心肌梗死后心功能恢復(fù)。心肌梗死是威脅人們生命健康的最常見的心血管疾病之一，心肌細(xì)胞缺氧是導(dǎo)致心肌梗死的重要原因。本實驗通過原代細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過缺氧培養(yǎng)制備心肌細(xì)胞缺氧模型，觀察缺氧后的一些損傷指標(biāo)特征和凋亡情況，探討IGF-1對缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新生1～3 d的KM小鼠，雌雄不限，用于原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(蘇)2020-0011]。

1.2 試劑與儀器

IGF-1（HY-P7070），美國 MedChemExpress公司；MTT試劑盒（C0009S），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基（PWL107），大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（085-150），維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；胰酶（C0201），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；II型膠原酶（QN0512），美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（A020-1-2）、肌酸激酶（CK）檢測試劑盒（A032-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（A001-3-2）以及丙二醛（MDA）檢測試劑盒（A003-1-2），南京建成生物工程研究所；兔抗alpha-Actin單克隆抗體（ab124964），英國Abcam公司；山羊抗兔紅色熒光二抗（ab150080），英國Abcam公司。

BX53熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；IX73光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Synergy2酶標(biāo)儀，美國BioTek公司。

1.3 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

預(yù)先配好0.08%胰蛋白酶、0.05%Ⅱ型膠原酶和0.04%胰蛋白酶等量配比的混合溶液。在無菌條件下快速取出乳鼠心臟，用D-Hanks液沖洗，在培養(yǎng)皿中將心臟剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的小碎塊。以0.08%胰蛋白酶消化5～8 min，靜置后棄去上清液，再用0.05%Ⅱ型膠原酶和0.04%胰蛋白酶混合液37 ℃消化10 min，吸取消化后的上清加入離心管中，再以同樣方法消化一次，兩次上清合并，向上清液中加入約1/3（體積）的DMEM/F12培養(yǎng)基以終止消化作用。過200目網(wǎng)篩，1 200 r/min轉(zhuǎn)速離心12 min。棄上清。用50 mL DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁，90 min后取細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min，所得沉淀用培養(yǎng)基輕輕吹散以純化心肌細(xì)胞。最后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度，接種于培養(yǎng)皿，48 h后更換培養(yǎng)液。

1.4 藥物預(yù)處理及缺氧模型建立

造模前24 h將狀態(tài)良好的細(xì)胞更換成無血清培養(yǎng)基。實驗分為3組，正常組即不做任何處理的細(xì)胞，缺氧組即模型組，細(xì)胞經(jīng)過缺氧處理，IGF-1預(yù)處理組在造模前1 h加入終濃度為200 ng/mL的IGF-1。正常組細(xì)胞在普通培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，缺氧組和IGF-1干預(yù)組細(xì)胞轉(zhuǎn)至缺氧培養(yǎng)箱（37 ℃，94% N2，l%O2，5% CO2）中孵育24 h進(jìn)行缺氧處理建立缺氧模型，隨后進(jìn)行各項檢測。

1.5 α-Actin染色鑒定心肌細(xì)胞純度

吸去培養(yǎng)基，將貼壁的心肌細(xì)胞用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次。4%的多聚甲醛固定細(xì)胞（4 ℃，20 min）吸干液體后用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次并吸去PBS。用10%正常羊血清（含0.3%TritonX-100）室溫封閉 1 h，然后吸干，加入α-Actin（1∶500）抗體并于4 ℃過夜。第二天將細(xì)胞先拿出復(fù)溫0.5 h，吸干抗體，0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次后吸干，加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶1 000)避光孵育1 h后PBS洗3次，并用DAPI核染液染細(xì)胞核5 min，后經(jīng)PBS洗3次，于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞活力

MTT溶液的配制：用5 mL MTT溶劑溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL的MTT溶液。配制后即刻使用，或分裝后-20 ℃避光保存。

通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100 μL 2 000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100 μL 5 000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予0～10 μL特定的藥物刺激。每孔加入10 μL MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解。在37 ℃下孵育4 h，然后在570 nm測定吸光度，按式（1）計算存活率。

細(xì)胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD） （1）

1.7 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的測定

按照之前分組，細(xì)胞經(jīng)缺氧后，收集各組細(xì)胞和上清，處理好樣品，按照各檢測試劑盒說明書操作，通過比色法測定各物質(zhì)含量、活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

利用圖像分析軟件和Photoshop 5.0軟件（Adobe）對圖像進(jìn)行處理，所有資料用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組比較用t檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-Actin免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞純度

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2 d的明場圖見圖1（a），心肌細(xì)胞純度常用α-Actin染色鑒定，見圖1（b），可見α-Actin染色呈陽性，純度大于95%。從圖中可以看見明顯的心肌特異性橫紋結(jié)構(gòu)，并且在鏡下可見心肌細(xì)胞成片同步搏動，表明心肌細(xì)胞狀態(tài)良好。

圖1 原代心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及α-Actin染色鑒定

2.2 IGF-1對心肌細(xì)胞活力的影響

運用MTT法測定各組心肌細(xì)胞活力，結(jié)果見表1。與正常組相比，缺氧組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），說明缺氧使心肌細(xì)胞存活率下降，對細(xì)胞活力造成影響；與缺氧組相比，IGF-1干預(yù)顯著提高了細(xì)胞存活率（P＜0.05），細(xì)胞活力明顯增強。IGF-1可以改善缺氧造成的細(xì)胞存活率降低，對細(xì)胞損傷有顯著抑制作用，這也體現(xiàn)了IGF-1的促生長調(diào)節(jié)的功能。

表1 各組心肌細(xì)胞存活率

2.3 IGF-1對LDH、CK、SOD活性以及MDA含量的影響

心肌細(xì)胞缺氧損傷后LDH、CK活性顯著升高（P＜0.05），說明缺氧造成心肌細(xì)胞明顯損傷，SOD活性下降（P＜0.05），MDA含量顯著上升（P＜0.05）。而IGF-1處理則緩解了這種損傷，明顯降低了LDH、CK活性（P＜0.05），使SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)見表2。LDH、CK、SOD活性和MDA含量可以評價細(xì)胞應(yīng)激損傷的程度。缺氧會造成細(xì)胞氧化系統(tǒng)的失衡，自由基堆積，引起細(xì)胞損傷。而IGF-1對這種應(yīng)激損傷具有一定抑制作用，可以減少心肌細(xì)胞氧自由基生成，有利于心肌損傷后的恢復(fù)。

表2 各組LDH、CK和SOD活性及MDA含量

3 結(jié)論

近年來，IGF-1在心血管疾病中的作用被重視。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可以促進(jìn)細(xì)胞生長和抵抗細(xì)胞死亡，與心肌細(xì)胞的發(fā)育和生長密切相關(guān)，顯示出對心血管疾病的保護(hù)作用[5]。另有研究報道，IGF-1在損傷心肌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，提示IGF-1在心肌損傷中的重要性[6]。

CK和LDH是臨床上評價心肌損傷的重要標(biāo)志物[7]。當(dāng)細(xì)胞損傷時，細(xì)胞膜破壞，胞內(nèi)的CK和LDH會釋放至細(xì)胞外使血液中含量顯著上升而被檢測到。SOD和MDA是與氧化應(yīng)激相關(guān)的兩個常用指標(biāo)。SOD活性與其清除自由基的能力相關(guān)，當(dāng)SOD活性下降時，清除自由基的能力就減弱，會導(dǎo)致大量自由基堆積[8]。而自由基堆積會進(jìn)一步使細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，MDA則反映了這種過氧化程度，還可間接反映受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[9]。心肌細(xì)胞缺氧后會發(fā)生一定損傷，細(xì)胞活力下降，CK和LDH活性明顯上升，而細(xì)胞清除自由基能力下降，即SOD活性下降，自由基堆積造成MDA含量顯著升高。已有研究表明，急性心肌梗死后，IGF-1可以改善其不利的微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)心肌修復(fù)[10-11]。本實驗中，筆者觀察到IGF-1預(yù)處理緩解了心肌細(xì)胞缺氧后的損傷變化，與缺氧組相比，IGF-1能夠顯著降低CK、LDH活性和MDA含量，提高SOD活性，提升細(xì)胞活力。

本次研究表明IGF-1是一個可以有效緩解心肌損傷的生長因子。其主要通過抗氧化增強清除自由基能力，增加損傷心肌細(xì)胞活力，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞缺氧損傷后的保護(hù)作用。