丁海虎，李澳峰，徐銀花

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

肝損傷是機(jī)體肝臟受各類(lèi)復(fù)雜致病因素影響而誘發(fā)肝臟發(fā)生病變的過(guò)程。有研究表明，藥品和生物制品對(duì)肝損傷進(jìn)程具有顯著干預(yù)作用，能夠有效保護(hù)肝功能[1]。環(huán)巴胺（Cyclopamine），又名環(huán)靶明，是一種從植物中提取分離而得到的生物堿，是Hedgehog（Hh）信號(hào)通路的特異性抑制劑，肝損傷后該信號(hào)通路可被激活，并參與包括促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞的增殖等過(guò)程[2-3]；此外，環(huán)巴胺可通過(guò)抑制該信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)從而影響肝再生[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究環(huán)巴胺預(yù)防性給藥對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型的干預(yù)作用及其可能的治療機(jī)制，為環(huán)巴胺臨床治療肝損傷提供理論基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

環(huán)巴胺凍干粉（批號(hào)：DST190314-087），HPLC≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司；四氯化碳溶液（CCl4）（批號(hào)：C805332），HPLC≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；橄欖油（批號(hào)：C10438063），分析純，上海麥克林生化科技有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、總膽紅素（TBil）以及谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)依次為：20200328、20200417、20200508、20200513），南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠40只，周齡7～8周，雌雄不限，體重（25±5）g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001號(hào)。飼養(yǎng)環(huán)境及方式：分籠飼養(yǎng)，動(dòng)物自由進(jìn)食任意飲水，12 h交替光照，恒溫22 ℃，相對(duì)濕度為50%～75%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7日后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器與設(shè)備

EPOCH型酶標(biāo)分析儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Velocity 18R pro臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，英國(guó)Dynamica；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；BX53（LED）半電動(dòng)熒光型顯微鏡，日本奧林巴斯（北京）公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)數(shù)表法將適應(yīng)飼養(yǎng)后的動(dòng)物隨機(jī)均分為4組，分別為正常對(duì)照組（n=10），模型組（n=10），環(huán)巴胺預(yù)防1、2組（每組n=10）。正常對(duì)照組給予腹腔注射等體積生理鹽水，其余3組通過(guò)腹腔注射2 mL/kg的40%CCl4-橄欖油混懸液（即CCl4濃度為0.8 mL/kg），每周2次，以建立肝損傷化小鼠模型。環(huán)巴胺預(yù)防1、2組在建模同時(shí)，分別給予濃度為1 mg/mL 的環(huán)巴胺 5 mg/（kg·d）、10 mg/（kg·d）腹腔注射。3周后最后一次給藥后禁食禁水12 h，按體重采用20%氨基甲酸乙酯溶液0.067 5 mL/10 g腹腔注射麻醉，眼球摘除法采集血樣。

1.4.2 肝指數(shù)測(cè)量

麻醉前稱重并記錄，待取血后，剖開(kāi)腹部取出肝組織，置于盛有提前預(yù)冷4 ℃生理鹽水培養(yǎng)皿中清洗肝臟數(shù)次至血液澄清，定性濾紙吸去水分后稱重計(jì)算肝指數(shù)。計(jì)算肝指數(shù)方法為：肝指數(shù)=[肝臟濕重（g）/小鼠體重（g）]×100%[6]。

1.4.3 生化指標(biāo)檢測(cè)肝功能

取血后靜置2 h，保持溫度為4 ℃，在臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以3 500 r/min離心10 min，取上層血清，采用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)TBil含量和T-SOD活性。在冰盒上切取0.3 g肝組織，加入3 mL預(yù)冷生理鹽水后剪成細(xì)塊，移入組織勻漿器中研磨，制備得10%肝勻漿以檢測(cè)MDA含量與GSH活性，方法參照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.4 肝臟病理學(xué)檢查

稱取肝濕重后均切取左外側(cè)葉置于4%的多聚甲醛中固定，再用刀片修整并取相同部位，按照程序進(jìn)行組織石蠟包埋、切片及HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并攝片保存分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以（±s）表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間事后多重檢驗(yàn)采用LSD法，方差不齊則事后多重檢驗(yàn)采用Tamhane’s T2法，P＜0.05表示組間差異具有顯著性[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)巴胺對(duì)小鼠體重、肝指數(shù)的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)前小鼠體重組間均衡無(wú)差異；通過(guò)3周造模、給藥處理后，動(dòng)物體重及肝指數(shù)結(jié)果均顯示：模型組較正常對(duì)照組顯著降低（分別為P＜0.05、P＜0.01）；環(huán)巴胺預(yù)防1、2組較正常對(duì)照組均略有降低，較模型組有所改善（P＜0.01），提示環(huán)巴胺對(duì)動(dòng)物體重和肝指數(shù)有一定干預(yù)作用，且兩者均與劑量成正相關(guān)性。

表1 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷化模型小鼠體重、肝指數(shù)的影響（±s）

表1 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷化模型小鼠體重、肝指數(shù)的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組相比，Δ表示P＜0.05，ΔΔ表示P＜0.01；與模型組相比，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。下同。

組別 劑量/[mg/（kg·d）]體重/g 肝指數(shù)/%實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后正常對(duì)照組 — 28.12±0.57 36.22±3.11 6.40±0.27模型組 — 27.77±1.05 29.53±1.18△ 5.12±0.45△△環(huán)巴胺預(yù)防組1 5 27.89±1.24 33.87±1.42## 6.26±0.18##環(huán)巴胺預(yù)防組2 10 27.65±1.39 34.23±1.44## 6.34±0.17##

2.2 環(huán)巴胺對(duì)小鼠血清T-SOD活性和TBil含量的影響

檢測(cè)血清T-SOD的活性，可在一定程度上反映內(nèi)源性氧自由基清除的能力[7]。由表2可知，模型組血清T-SOD活性較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），提示CCl4誘導(dǎo)3周可使小鼠機(jī)體清除超氧自由基的能力減弱；環(huán)巴胺預(yù)防1、2組血清T-SOD活性較模型組顯著升高（分別為P＜0.05、P＜0.01），且與劑量呈正相關(guān)性，較正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明其可通過(guò)提高小鼠機(jī)體清除自由基的能力來(lái)保護(hù)肝組織。

人體內(nèi)絕大部分TBil來(lái)源于被破壞的衰老紅細(xì)胞，當(dāng)肝臟或膽道出現(xiàn)疾病時(shí)均可出現(xiàn)TBil的升高[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)表2），與正常對(duì)照組相比，模型組血清TBil含量顯著升高（P＜0.01）；環(huán)巴胺預(yù)防1、2組均能顯著下調(diào)TBil水平（P＜0.01），表明CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟處理的能力下降，而環(huán)巴胺可通過(guò)干預(yù)該過(guò)程而提高機(jī)體肝臟處理TBil能力。

表2 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清T-SOD、TBil的影響（±s）

表2 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清T-SOD、TBil的影響（±s）

組別 劑量/[mg/（kg·d）]T-SOD/（U/mL）TBil/(μmol/L)正常對(duì)照組 — 83.79±7.92 4.69±1.40模型組 — 76.82±4.02△ 9.83±1.35△△環(huán)巴胺預(yù)防組1 5 81.26±3.63# 5.98±2.53##環(huán)巴胺預(yù)防組2 10 82.72±2.84## 6.43±1.35##

2.3 環(huán)巴胺對(duì)小鼠肝組織MDA、GSH的影響

機(jī)體內(nèi)MDA水平在肝損傷模型中用于評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化情況[7]。由表3可知，模型組肝組織MDA含量較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，環(huán)巴胺預(yù)防1、2組血清MDA含量均顯著下降（P＜0.05），提示CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機(jī)制可能是脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，環(huán)巴胺可能通過(guò)干預(yù)氧化酶活性來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。

GSH是肝細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化物，對(duì)肝損傷有保護(hù)和修復(fù)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)表3），模型組肝組織的GSH活性較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），可能是因?yàn)镃Cl4誘導(dǎo)使動(dòng)物機(jī)體氧化程度增強(qiáng)，自由基產(chǎn)生增多造成了明顯的氧化損傷；環(huán)巴胺預(yù)防1、2組較模型組雖有一定升高，且與劑量呈正比關(guān)系，但差異不顯著。

表3 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響（±s）

表3 環(huán)巴胺對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響（±s）

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2.4 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

小鼠肝組織切片病理學(xué)結(jié)果如圖1所示。正常對(duì)照組肝組織各視野范圍內(nèi)未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變；模型組肝組織鏡下形態(tài)呈現(xiàn)肝細(xì)胞彌漫分布的點(diǎn)狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)上肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞索排列紊亂；環(huán)巴胺預(yù)防1、2組肝內(nèi)條索分割明顯，水腫現(xiàn)象明顯減少，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)但不典型，表明環(huán)巴胺可減輕肝細(xì)胞的損傷。

圖1 小鼠肝組織病理學(xué)光鏡圖（HE染色，×100）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

延緩肝損傷進(jìn)程或消除長(zhǎng)期存在的肝損傷因素，避免肝組織由纖維化發(fā)展為肝硬化乃至肝癌的發(fā)病機(jī)制和藥物治療研究，一直是關(guān)系人類(lèi)肝臟健康的熱點(diǎn)[7]?；瘜W(xué)性肝損傷是研究肝損傷常采用的動(dòng)物模型之一，采用腹腔注射CCl4造模方法簡(jiǎn)便，可準(zhǔn)確反映肝損傷后的功能、形態(tài)和代謝的變化，且在可控劑量?jī)?nèi)動(dòng)物生存率較高[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用2 mL/kg的40%CCl4-橄欖油混懸液，即CCl4終濃度0.8 mL/kg，經(jīng)腹腔注射吸收進(jìn)入小鼠機(jī)體內(nèi)15 min左右即可引起肝細(xì)胞損傷，2 d抵達(dá)峰點(diǎn)后進(jìn)入修復(fù)階段[4,11]。故本實(shí)驗(yàn)在建立肝損傷模型的時(shí)間上采用間隔3～4 d（即固定在每周周一與周四），以保障動(dòng)物的生存率，結(jié)果表明該模型建立方法符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。有研究表明，急性肝損傷可表現(xiàn)為肝組織大量壞死，慢性肝損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要表現(xiàn)出細(xì)胞外基質(zhì)大量過(guò)度沉積，肝損傷中氧自由基消除失衡，過(guò)度滯留肝內(nèi)而啟動(dòng)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變而釋放大量酶終致失活，引發(fā)肝損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到CCl4誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體內(nèi)與清除自由基相關(guān)T-SOD、GSH酶活性發(fā)生了改變，過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA、肝損傷產(chǎn)物TBil顯著升高，提示環(huán)巴胺的干預(yù)機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟組織中氧自由基的產(chǎn)生與消除平衡從而起到肝保護(hù)的作用。

Hh是一種形態(tài)發(fā)生信號(hào)通路，在胚胎發(fā)生過(guò)程中控制祖細(xì)胞的途徑和組織構(gòu)建，發(fā)生在成人許多類(lèi)型的肝損傷中[13]。肝疾病相關(guān)研究表明，該信號(hào)通路在肝損傷后可被激活，并參與如促肝祖細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞聚集等過(guò)程，這些進(jìn)程都參與了后期肝硬化的發(fā)病機(jī)制[2,13]。預(yù)防性腹腔注射給予1 mg/mL濃度的環(huán)巴胺 5 mg/（kg·d）和 10 mg/（kg·d），在 3 周內(nèi)能對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有干預(yù)作用，且毒副作用小[4]。本研究采用CCl4誘導(dǎo)肝損傷化的方法以研究肝損傷化發(fā)生機(jī)制，并對(duì)環(huán)巴胺進(jìn)行抗肝損傷化療效的評(píng)價(jià)，初步探究環(huán)巴胺基于氧化應(yīng)激可能的肝保護(hù)機(jī)制，其對(duì)Hh信號(hào)通路的分子調(diào)控是本實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究的方向。已有研究顯示環(huán)巴胺在抗腫瘤等方面有良好的前景，但在致畸作用和對(duì)其他組織器官毒副作用方面尚缺乏完整評(píng)價(jià)，在進(jìn)入臨床使用之前還需要進(jìn)行多方面的深入研究[14-16]。

3.2 結(jié)論

綜上，環(huán)巴胺在肝損傷小鼠體內(nèi)具有明顯的抗肝損傷作用，但其在人體內(nèi)的抗肝損傷等作用機(jī)理有待研究和探索。