張金龍，張玉瑋，李廣華，張明娟

（聊城市檢驗檢測中心，山東聊城 252000）

阿膠始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》（2020年版，以下簡稱新版《藥典》）一部“阿膠”項下，規(guī)定“阿膠為馬科動物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠”[1]。阿膠作為中藥材應用于臨床疾病的治療，還能制成食品、保健品增強人體免疫力。目前，市場上的阿膠產(chǎn)品有阿膠塊、阿膠粉、阿膠糕、阿膠膏、阿膠口服液和阿膠棗等，阿膠產(chǎn)品因其特有的養(yǎng)生保健功效而深受歡迎。市場需求持續(xù)增長，阿膠的價格也節(jié)節(jié)攀升，有不法分子為牟利摻雜牛、馬、騾、豬等雜皮制作假阿膠，甚至用工業(yè)廢料制膠，致使阿膠質(zhì)量存在較大風險，藥品及食品安全性受到威脅。因此，新版《藥典》加強了對特征多肽含量的測定，以加強對藥品阿膠的質(zhì)量控制。2019年，山東阿膠行業(yè)協(xié)會發(fā)布了《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）、《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）兩項團體標準，以改變阿膠糕質(zhì)量標準低、部分檢測指標缺乏專屬性、難以對雜皮造假和摻假的現(xiàn)象進行有效檢測和監(jiān)管的現(xiàn)狀[2-5]。2021年3月，山東省開展風險監(jiān)測阿膠專項，本次風險監(jiān)測以藥品阿膠、阿膠珠檢驗為主，同時對保健食品阿膠及阿膠糕的產(chǎn)品質(zhì)量進行隨行檢查，探討新標準執(zhí)行以來阿膠產(chǎn)品質(zhì)量的控制情況。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

專項抽檢共收到阿膠樣品67批（其中藥品阿膠41批，來自全省4個地級市，涉及生產(chǎn)企業(yè)9家；阿膠珠9批，來自全省2個地級市，涉及生產(chǎn)企業(yè)3家；食品（保健食品）阿膠17批，來自全國3省4市，涉及生產(chǎn)企業(yè)12家）；收集市售阿膠糕樣品19批。

1.2 試劑

甲酸、乙腈均為色譜純，Adamas（上海）有限公司；磷酸，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶，序列分析級，德國Sigma公司；L-羥脯氨酸對照品（111578-200201）、甘氨酸對照品（140689-201103）、丙氨酸對照品（104680-201002）、L-脯氨酸對照品（140677-201206）、阿膠對照藥材（121274-201904）、新阿膠對照藥材（121745-201701）、黃明膠對照藥材（121695-201301）、龜甲膠對照藥材（121693-201702）、牛皮特征肽A對照品（111941-201804）、馬源寡肽A對照品（112035-201702），中國食品藥品檢定研究院；鉛鎘砷汞銅混合對照溶液（610014-201701），中國食品藥品檢定研究院。

1.3 儀器

Triple Quad 5500+高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），美國AB SCIEX公司；AB-135S電子天平，瑞士Mettler公司；Memmert-HPP260恒溫恒濕箱，美國Merk Millipore公司；Milli-Q Integral超純水儀，美國Merk Millipore公司；2695高效液相色譜儀，配備Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Waters公司；7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Agilent公司。

1.4 實驗方法

藥品阿膠按照新版《藥典》一部“阿膠”項下規(guī)定進行檢驗。食品阿膠及阿膠糕按照《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）、《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）兩項團體標準進行檢驗。探索性研究參考《阿膠中豬皮源成分檢查項補充檢驗方法》（BJY 201917）、《阿膠中牛皮源含量的補充檢驗方法》（2012001）和《阿膠中鉻（Cr）含量檢查的補充檢驗方法》（20110122）。

1.4.1 性狀

正常光線和室溫條件下，目測其組織形態(tài)、色澤，嗅其氣味，品嘗其滋味。

1.4.2 鑒別

（1）色譜-質(zhì)譜條件：乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，進樣量5 μL；梯度洗脫方式：0 min，95%B；25 min，80%B；40 min，50%B；0.3 mL/min。電噴霧離子化（ESI），正離子模式，多反應監(jiān)測（MRM）。檢測離子對m/z分別為539.8（雙電荷）→612.4和539.8（雙電荷）→923.8。

（2）樣品處理：取樣品粉末或阿膠對照藥材0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，用微孔濾膜過濾；取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液，臨用時配制），搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h。

1.4.3 檢查

（1）水分。取待檢樣品1 g，精密稱定，加水2 mL，加熱溶解后置水浴上蒸干，使厚度不超過2 mm，按照“水分測定法”要求進行測定。

（2）重金屬及有害元素。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定中藥中的鉛、砷、鎘、汞、銅元素，儀器條件：射頻功率為1 500 W；采樣深度為8.0 mm；等離子體氣流量為15 L/min；輔助氣流量為1.0 L/min；載氣流量為1.0 L/min；樣品提升速率為1.0 mL/min；采用定量分析模式。

（3）標準品溶液制備：用10%硝酸溶液稀釋鉛、砷、鎘、銅標準品貯備液，制成每1 mL含鉛、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng和 20 ng，含鎘 0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5.0 ng 和 10.0 ng，含銅 0 ng、50 ng、100 ng、200 ng和500 ng的系列濃度混合溶液。另精密量取汞標準品貯備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL分別含汞 0 ng、0.2 ng、0.5 ng、1.0 ng、2.0 ng、5.0 ng的溶液。

（4）供試品溶液制備：精密稱取樣品粗粉，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5～10 mL，密閉并按消解程序進行消解、定容。

1.4.4 阿膠氨基酸含量測定

（1）色譜條件：乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉溶液（用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）（體積比7∶93）為流動相A，乙腈-水（體積比4∶1）為流動相B；進樣量5 μL；梯度洗脫方式：0 min，0%B；11 min，7%B；13.9 min，12%B；14 min，15%B；29 min，34%B；30 min，100%B。

（2）對照品溶液制備：加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成每1 ml分別含L-羥脯氨酸80 μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液。

（3）供試品溶液制備：精密稱定樣品粗粉0.25 g，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲30 min，冷卻至室溫后加0.1 mol/L鹽酸溶液定容。精密量取2 mL超聲后溶液于5 mL安瓿瓶中，加鹽酸2 mL，150 ℃水解1 h，冷卻至室溫后移至蒸發(fā)皿中；分多次加入10 mL水洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容。

（4）衍生化：精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各5 mL，分別置25 mL量瓶中，各加0.1 mol/L異硫氫酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL和l mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后加50%乙腈至刻度，搖勻。取10 mL溶液加正己烷10 mL，振搖后放置10 min，取下層溶液，過濾后續(xù)濾液即為色譜進樣液。

1.4.5 特征多肽含量測定

（1）除檢測離子對外，其他色譜-質(zhì)譜條件同1.4.2（1）。以對照品峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標制備標準曲線。從標準曲線讀出供試品溶液中相當于驢源多肽A1（LPT A1）和驢源多肽A2（LPT A2）的量進行計算。

（2）對照品溶液制備：取驢源多肽A1對照品、驢源多肽A2對照品適量，精密稱定，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL含2.5 μg的混合溶液。精密量取對照品溶液1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL和25 mL，分別置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，制成標準曲線溶液。

（3）供試品溶液制備：精密稱定樣品粉末0.1 g于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液定容。精密量取l mL超聲后溶液至5 mL量瓶中，加l mL胰蛋白酶溶液（用1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液），加1%碳酸氫銨溶液定容，37 ℃恒溫酶解12 h，過濾后取續(xù)濾液。

1.4.6 雜皮源篩查

（1）除檢測離子對外，其他色譜-質(zhì)譜條件同1.4.2（1）。利用馬源寡肽A、新阿膠對照藥材及牛皮特征肽A分別檢查是否混有馬（騾）源、豬皮源及牛皮源成分[2-3,6-7]。

（2）阿膠樣品溶液制備：取樣品粉末0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，過濾后取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL，37 ℃恒溫酶解12 h。

（3）阿膠糕樣品溶液制備：稱樣品5.0 g于50 mL容量瓶中，加水并超聲至充分溶解，用水稀釋至刻度，制得試樣懸濁液。取10 mL試樣懸濁液于3 000 r/min離心5 min，取離心后的清液5 mL，緩緩加入等體積的30%三氯乙酸溶液，充分振蕩混勻，4 ℃靜置20 min，8 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL冷丙酮洗滌沉淀，8 000 r/min離心5 min后棄丙酮清液；再用2 mL丙酮重復洗滌并棄去丙酮清液，室溫放置10 min揮干丙酮，制得阿膠提取物。

向阿膠提取物中加入1%碳酸氫銨溶液超聲溶解，將溶液移入25 mL容量瓶內(nèi)并用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度。吸取溶液過0.22 μm濾膜，取400 μL續(xù)濾液，加40 μL胰蛋白酶溶液，混勻，37 ℃恒溫酶解12 h，制得待測液。

1.4.7 鉻含量檢測

（1）標準溶液的制備：精密量取鉻標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成每1 mL含鉻0 ng、0.125 ng、0.250 ng、0.500 ng、2.500 ng、5.000 ng、10.000 ng的系列濃度樣品。

（2）樣品制備及檢驗方法同1.4.3（2）[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀結(jié)果

按照新版《藥典》一部對41批藥品阿膠、9批阿膠珠進行性狀檢驗，按《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）對17批食品（保健食品）阿膠進行性狀檢驗，按照《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）對19批阿膠糕進行性狀檢驗[1-3]。結(jié)果表明，41批藥品阿膠、9批阿膠珠、17批食品(保健食品)阿膠和19批阿膠糕的性狀均符合規(guī)定。典型樣品性狀見圖1。

圖1 典型阿膠產(chǎn)品形狀

2.2 鑒別結(jié)果

按照1.4.2所述實驗方法鑒別樣品。結(jié)果表明，所有藥品阿膠及阿膠珠樣品均呈現(xiàn)與對照藥材色譜保留時間一致的色譜峰，4批食品（保健食品）阿膠未檢出與對照藥材色譜保留時間一致的色譜峰，8批阿膠糕未檢出與對照藥材色譜保留時間一致的色譜峰。對照藥材色譜峰圖見圖2。

圖2 阿膠對照藥材監(jiān)測離子對LC-MS圖

2.3 檢查

2.3.1 水分測定結(jié)果

按照新版《藥典》規(guī)定，阿膠水分≤15.0%，阿膠珠水分≤10.0%[1]。實驗結(jié)果表明，藥品阿膠水分10.8%～14.7%，食品（保健食品）阿膠水分9.4%～13.5%，阿膠珠水分1.4%～6.8%；67批樣品全部符合規(guī)定。

2.3.2 重金屬及有害元素測定結(jié)果

新版《藥典》規(guī)定，阿膠產(chǎn)品中鉛、鎘、砷、汞和銅的含量分別不超過5.0 mg/kg、0.3 mg/kg、2.0 mg/kg、0.2 mg/kg和20.0 mg/kg。實驗結(jié)果表明，藥品阿膠（含阿膠珠）中鉛的含量為0.005～0.963 mg/kg，鎘的含量為0.001～0.011 mg/kg，砷的含量為0.014～0.124 mg/kg，汞的含量為0.0001～0.0035 mg/kg，銅的含量為0.2～2.0 mg/kg；食品（保健食品）阿膠中鉛的含量為0.005～0.238 mg/kg，鎘的含量為0.001～0.010 mg/kg，砷的含量為0.027～0.416 mg/kg，汞的含量為0.000 2～0.023 5 mg/kg，銅的含量為0.3～16.4 mg/kg；67批樣品全部符合規(guī)定。

2.4 阿膠氨基酸含量測定結(jié)果

氨基酸混合對照品溶液及供試品溶液的液相色譜圖見圖3，10.402 min、12.368 min、16.105 min和16.747 min的色譜峰分別對應羥脯氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸和甘氨酸。標準規(guī)定，按干燥品計算，阿膠產(chǎn)品L-羥脯氨酸含量≥8.0%，甘氨酸含量≥18.0%，丙氨酸含量≥7.0%，L-脯氨酸含量≥10.0%。實驗結(jié)果表明，41批藥品阿膠及9批阿膠珠氨基酸含量均符合藥典規(guī)定，合格率為100.0%；17批食品（保健食品）阿膠中有2批氨基酸含量測定值低于規(guī)定值（其中1批甘氨酸含量17.4%，L-脯氨酸含量9.8%；另外1批甘氨酸含量16.3%，L-脯氨酸含量8.9%），合格率為88.2%。

圖3 氨基酸混合對照品溶液色譜峰

2.5 特征多肽含量測定結(jié)果

藥材對照品驢源多肽對照品質(zhì)譜檢測結(jié)果見圖4，樣品驢源多肽含量測定結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，41批藥品阿膠驢源多肽含量0.16%～0.25%，9批阿膠珠驢源多肽含量0.16%～0.23%，全部符合新版《藥典》的規(guī)定；17批食品（保健品）阿膠含量在0.04%～0.22%，其中6批少于0.15%，不符合新版《藥典》規(guī)定。

圖4 驢源多肽對照品監(jiān)測離子對LC-MS圖

圖5 樣品中驢源多肽含量檢測結(jié)果

2.6 探索性研究

2.6.1 雜皮源篩查

雜皮源篩查結(jié)果顯示，41批藥品阿膠及9批阿膠珠均呈現(xiàn)與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰；食品（保健食品）阿膠中有13批樣品均呈現(xiàn)與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰，3批樣品呈現(xiàn)與牛皮特征肽A保留時間一致的色譜峰，1批樣品呈現(xiàn)與牛皮特征肽A和新阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰；阿膠糕中有5批樣品呈現(xiàn)與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰且無其他雜皮源特征峰，5批樣品除了具有與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰外還有與其他雜皮源特征峰保留時間一致的色譜峰，9批樣品未呈現(xiàn)與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰，5批呈現(xiàn)與馬皮源特征峰保留時間一致的色譜峰，10批呈現(xiàn)與牛皮源特征峰保留時間一致的色譜峰，5批呈現(xiàn)與豬皮源特征峰保留時間一致的色譜峰，部分批次樣品表現(xiàn)為多種特征峰摻雜。

2.6.2 鉻（Cr）含量檢測

《阿膠中鉻（Cr）含量檢查的補充檢驗方法》規(guī)定，阿膠中鉻含量應≤2.0 mg/kg。實驗結(jié)果顯示，藥品阿膠中鉻含量為0.077～0.442 mg/kg；食品（保健食品）阿膠中鉻含量為0.103～1.230 mg/kg；阿膠糕中鉻的含量為0.000～2.230 mg/kg，其中有1批超出限度要求。

3 結(jié)論

通過本次風險監(jiān)測專項檢驗發(fā)現(xiàn)，新的質(zhì)量標準項目設(shè)置合理，能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，新增特征多肽的含量測定能杜絕雜皮源的摻入；藥品阿膠及阿膠珠總體質(zhì)量狀況較好，未發(fā)現(xiàn)摻偽造假情況；食品（保健食品）阿膠特別是阿膠糕總體質(zhì)量狀況較差，存在以雜皮、劣質(zhì)皮投料生產(chǎn)的情況。建議生產(chǎn)企業(yè)積極參加技術(shù)培訓，加強原藥材的采購、使用管理，嚴把質(zhì)量關(guān)；監(jiān)管部門加強對生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)督檢查，針對雜皮投料問題，對生產(chǎn)企業(yè)進行現(xiàn)場檢查，從源頭控制產(chǎn)品的質(zhì)量。