張金龍，張玉瑋，李廣華，張明娟

（聊城市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東聊城 252000）

阿膠始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版，以下簡(jiǎn)稱新版《藥典》）一部“阿膠”項(xiàng)下，規(guī)定“阿膠為馬科動(dòng)物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠”[1]。阿膠作為中藥材應(yīng)用于臨床疾病的治療，還能制成食品、保健品增強(qiáng)人體免疫力。目前，市場(chǎng)上的阿膠產(chǎn)品有阿膠塊、阿膠粉、阿膠糕、阿膠膏、阿膠口服液和阿膠棗等，阿膠產(chǎn)品因其特有的養(yǎng)生保健功效而深受歡迎。市場(chǎng)需求持續(xù)增長(zhǎng)，阿膠的價(jià)格也節(jié)節(jié)攀升，有不法分子為牟利摻雜牛、馬、騾、豬等雜皮制作假阿膠，甚至用工業(yè)廢料制膠，致使阿膠質(zhì)量存在較大風(fēng)險(xiǎn)，藥品及食品安全性受到威脅。因此，新版《藥典》加強(qiáng)了對(duì)特征多肽含量的測(cè)定，以加強(qiáng)對(duì)藥品阿膠的質(zhì)量控制。2019年，山東阿膠行業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布了《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）、《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）兩項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，以改變阿膠糕質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低、部分檢測(cè)指標(biāo)缺乏專屬性、難以對(duì)雜皮造假和摻假的現(xiàn)象進(jìn)行有效檢測(cè)和監(jiān)管的現(xiàn)狀[2-5]。2021年3月，山東省開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)阿膠專項(xiàng)，本次風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)以藥品阿膠、阿膠珠檢驗(yàn)為主，同時(shí)對(duì)保健食品阿膠及阿膠糕的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行隨行檢查，探討新標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行以來(lái)阿膠產(chǎn)品質(zhì)量的控制情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

專項(xiàng)抽檢共收到阿膠樣品67批（其中藥品阿膠41批，來(lái)自全省4個(gè)地級(jí)市，涉及生產(chǎn)企業(yè)9家；阿膠珠9批，來(lái)自全省2個(gè)地級(jí)市，涉及生產(chǎn)企業(yè)3家；食品（保健食品）阿膠17批，來(lái)自全國(guó)3省4市，涉及生產(chǎn)企業(yè)12家）；收集市售阿膠糕樣品19批。

1.2 試劑

甲酸、乙腈均為色譜純，Adamas（上海）有限公司；磷酸，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶，序列分析級(jí)，德國(guó)Sigma公司；L-羥脯氨酸對(duì)照品（111578-200201）、甘氨酸對(duì)照品（140689-201103）、丙氨酸對(duì)照品（104680-201002）、L-脯氨酸對(duì)照品（140677-201206）、阿膠對(duì)照藥材（121274-201904）、新阿膠對(duì)照藥材（121745-201701）、黃明膠對(duì)照藥材（121695-201301）、龜甲膠對(duì)照藥材（121693-201702）、牛皮特征肽A對(duì)照品（111941-201804）、馬源寡肽A對(duì)照品（112035-201702），中國(guó)食品藥品檢定研究院；鉛鎘砷汞銅混合對(duì)照溶液（610014-201701），中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 儀器

Triple Quad 5500+高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），美國(guó)AB SCIEX公司；AB-135S電子天平，瑞士Mettler公司；Memmert-HPP260恒溫恒濕箱，美國(guó)Merk Millipore公司；Milli-Q Integral超純水儀，美國(guó)Merk Millipore公司；2695高效液相色譜儀，配備Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)Waters公司；7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

藥品阿膠按照新版《藥典》一部“阿膠”項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。食品阿膠及阿膠糕按照《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）、《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）兩項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。探索性研究參考《阿膠中豬皮源成分檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》（BJY 201917）、《阿膠中牛皮源含量的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》（2012001）和《阿膠中鉻（Cr）含量檢查的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》（20110122）。

1.4.1 性狀

正常光線和室溫條件下，目測(cè)其組織形態(tài)、色澤，嗅其氣味，品嘗其滋味。

1.4.2 鑒別

（1）色譜-質(zhì)譜條件：乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫方式：0 min，95%B；25 min，80%B；40 min，50%B；0.3 mL/min。電噴霧離子化（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。檢測(cè)離子對(duì)m/z分別為539.8（雙電荷）→612.4和539.8（雙電荷）→923.8。

（2）樣品處理：取樣品粉末或阿膠對(duì)照藥材0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，用微孔濾膜過(guò)濾；取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液，臨用時(shí)配制），搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h。

1.4.3 檢查

（1）水分。取待檢樣品1 g，精密稱定，加水2 mL，加熱溶解后置水浴上蒸干，使厚度不超過(guò)2 mm，按照“水分測(cè)定法”要求進(jìn)行測(cè)定。

（2）重金屬及有害元素。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定中藥中的鉛、砷、鎘、汞、銅元素，儀器條件：射頻功率為1 500 W；采樣深度為8.0 mm；等離子體氣流量為15 L/min；輔助氣流量為1.0 L/min；載氣流量為1.0 L/min；樣品提升速率為1.0 mL/min；采用定量分析模式。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：用10%硝酸溶液稀釋鉛、砷、鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，制成每1 mL含鉛、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng和 20 ng，含鎘 0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5.0 ng 和 10.0 ng，含銅 0 ng、50 ng、100 ng、200 ng和500 ng的系列濃度混合溶液。另精密量取汞標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL分別含汞 0 ng、0.2 ng、0.5 ng、1.0 ng、2.0 ng、5.0 ng的溶液。

（4）供試品溶液制備：精密稱取樣品粗粉，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5～10 mL，密閉并按消解程序進(jìn)行消解、定容。

1.4.4 阿膠氨基酸含量測(cè)定

（1）色譜條件：乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉溶液（用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）（體積比7∶93）為流動(dòng)相A，乙腈-水（體積比4∶1）為流動(dòng)相B；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫方式：0 min，0%B；11 min，7%B；13.9 min，12%B；14 min，15%B；29 min，34%B；30 min，100%B。

（2）對(duì)照品溶液制備：加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成每1 ml分別含L-羥脯氨酸80 μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液。

（3）供試品溶液制備：精密稱定樣品粗粉0.25 g，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲30 min，冷卻至室溫后加0.1 mol/L鹽酸溶液定容。精密量取2 mL超聲后溶液于5 mL安瓿瓶中，加鹽酸2 mL，150 ℃水解1 h，冷卻至室溫后移至蒸發(fā)皿中；分多次加入10 mL水洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容。

（4）衍生化：精密量取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 mL，分別置25 mL量瓶中，各加0.1 mol/L異硫氫酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL和l mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后加50%乙腈至刻度，搖勻。取10 mL溶液加正己烷10 mL，振搖后放置10 min，取下層溶液，過(guò)濾后續(xù)濾液即為色譜進(jìn)樣液。

1.4.5 特征多肽含量測(cè)定

（1）除檢測(cè)離子對(duì)外，其他色譜-質(zhì)譜條件同1.4.2（1）。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中相當(dāng)于驢源多肽A1（LPT A1）和驢源多肽A2（LPT A2）的量進(jìn)行計(jì)算。

（2）對(duì)照品溶液制備：取驢源多肽A1對(duì)照品、驢源多肽A2對(duì)照品適量，精密稱定，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL含2.5 μg的混合溶液。精密量取對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL和25 mL，分別置50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

（3）供試品溶液制備：精密稱定樣品粉末0.1 g于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液定容。精密量取l mL超聲后溶液至5 mL量瓶中，加l mL胰蛋白酶溶液（用1%碳酸氫銨溶液制成1 mg/mL的溶液），加1%碳酸氫銨溶液定容，37 ℃恒溫酶解12 h，過(guò)濾后取續(xù)濾液。

1.4.6 雜皮源篩查

（1）除檢測(cè)離子對(duì)外，其他色譜-質(zhì)譜條件同1.4.2（1）。利用馬源寡肽A、新阿膠對(duì)照藥材及牛皮特征肽A分別檢查是否混有馬（騾）源、豬皮源及牛皮源成分[2-3,6-7]。

（2）阿膠樣品溶液制備：取樣品粉末0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾后取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL，37 ℃恒溫酶解12 h。

（3）阿膠糕樣品溶液制備：稱樣品5.0 g于50 mL容量瓶中，加水并超聲至充分溶解，用水稀釋至刻度，制得試樣懸濁液。取10 mL試樣懸濁液于3 000 r/min離心5 min，取離心后的清液5 mL，緩緩加入等體積的30%三氯乙酸溶液，充分振蕩混勻，4 ℃靜置20 min，8 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL冷丙酮洗滌沉淀，8 000 r/min離心5 min后棄丙酮清液；再用2 mL丙酮重復(fù)洗滌并棄去丙酮清液，室溫放置10 min揮干丙酮，制得阿膠提取物。

向阿膠提取物中加入1%碳酸氫銨溶液超聲溶解，將溶液移入25 mL容量瓶?jī)?nèi)并用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度。吸取溶液過(guò)0.22 μm濾膜，取400 μL續(xù)濾液，加40 μL胰蛋白酶溶液，混勻，37 ℃恒溫酶解12 h，制得待測(cè)液。

1.4.7 鉻含量檢測(cè)

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密量取鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成每1 mL含鉻0 ng、0.125 ng、0.250 ng、0.500 ng、2.500 ng、5.000 ng、10.000 ng的系列濃度樣品。

（2）樣品制備及檢驗(yàn)方法同1.4.3（2）[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀結(jié)果

按照新版《藥典》一部對(duì)41批藥品阿膠、9批阿膠珠進(jìn)行性狀檢驗(yàn)，按《阿膠》（T/SDEJ 01—2019）對(duì)17批食品（保健食品）阿膠進(jìn)行性狀檢驗(yàn)，按照《阿膠糕》（T/SDEJ 02—2019）對(duì)19批阿膠糕進(jìn)行性狀檢驗(yàn)[1-3]。結(jié)果表明，41批藥品阿膠、9批阿膠珠、17批食品(保健食品)阿膠和19批阿膠糕的性狀均符合規(guī)定。典型樣品性狀見(jiàn)圖1。

圖1 典型阿膠產(chǎn)品形狀

2.2 鑒別結(jié)果

按照1.4.2所述實(shí)驗(yàn)方法鑒別樣品。結(jié)果表明，所有藥品阿膠及阿膠珠樣品均呈現(xiàn)與對(duì)照藥材色譜保留時(shí)間一致的色譜峰，4批食品（保健食品）阿膠未檢出與對(duì)照藥材色譜保留時(shí)間一致的色譜峰，8批阿膠糕未檢出與對(duì)照藥材色譜保留時(shí)間一致的色譜峰。對(duì)照藥材色譜峰圖見(jiàn)圖2。

圖2 阿膠對(duì)照藥材監(jiān)測(cè)離子對(duì)LC-MS圖

2.3 檢查

2.3.1 水分測(cè)定結(jié)果

按照新版《藥典》規(guī)定，阿膠水分≤15.0%，阿膠珠水分≤10.0%[1]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥品阿膠水分10.8%～14.7%，食品（保健食品）阿膠水分9.4%～13.5%，阿膠珠水分1.4%～6.8%；67批樣品全部符合規(guī)定。

2.3.2 重金屬及有害元素測(cè)定結(jié)果

新版《藥典》規(guī)定，阿膠產(chǎn)品中鉛、鎘、砷、汞和銅的含量分別不超過(guò)5.0 mg/kg、0.3 mg/kg、2.0 mg/kg、0.2 mg/kg和20.0 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥品阿膠（含阿膠珠）中鉛的含量為0.005～0.963 mg/kg，鎘的含量為0.001～0.011 mg/kg，砷的含量為0.014～0.124 mg/kg，汞的含量為0.0001～0.0035 mg/kg，銅的含量為0.2～2.0 mg/kg；食品（保健食品）阿膠中鉛的含量為0.005～0.238 mg/kg，鎘的含量為0.001～0.010 mg/kg，砷的含量為0.027～0.416 mg/kg，汞的含量為0.000 2～0.023 5 mg/kg，銅的含量為0.3～16.4 mg/kg；67批樣品全部符合規(guī)定。

2.4 阿膠氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

氨基酸混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖3，10.402 min、12.368 min、16.105 min和16.747 min的色譜峰分別對(duì)應(yīng)羥脯氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸和甘氨酸。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，按干燥品計(jì)算，阿膠產(chǎn)品L-羥脯氨酸含量≥8.0%，甘氨酸含量≥18.0%，丙氨酸含量≥7.0%，L-脯氨酸含量≥10.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，41批藥品阿膠及9批阿膠珠氨基酸含量均符合藥典規(guī)定，合格率為100.0%；17批食品（保健食品）阿膠中有2批氨基酸含量測(cè)定值低于規(guī)定值（其中1批甘氨酸含量17.4%，L-脯氨酸含量9.8%；另外1批甘氨酸含量16.3%，L-脯氨酸含量8.9%），合格率為88.2%。

圖3 氨基酸混合對(duì)照品溶液色譜峰

2.5 特征多肽含量測(cè)定結(jié)果

藥材對(duì)照品驢源多肽對(duì)照品質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，樣品驢源多肽含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，41批藥品阿膠驢源多肽含量0.16%～0.25%，9批阿膠珠驢源多肽含量0.16%～0.23%，全部符合新版《藥典》的規(guī)定；17批食品（保健品）阿膠含量在0.04%～0.22%，其中6批少于0.15%，不符合新版《藥典》規(guī)定。

圖4 驢源多肽對(duì)照品監(jiān)測(cè)離子對(duì)LC-MS圖

圖5 樣品中驢源多肽含量檢測(cè)結(jié)果

2.6 探索性研究

2.6.1 雜皮源篩查

雜皮源篩查結(jié)果顯示，41批藥品阿膠及9批阿膠珠均呈現(xiàn)與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰；食品（保健食品）阿膠中有13批樣品均呈現(xiàn)與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰，3批樣品呈現(xiàn)與牛皮特征肽A保留時(shí)間一致的色譜峰，1批樣品呈現(xiàn)與牛皮特征肽A和新阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰；阿膠糕中有5批樣品呈現(xiàn)與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰且無(wú)其他雜皮源特征峰，5批樣品除了具有與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰外還有與其他雜皮源特征峰保留時(shí)間一致的色譜峰，9批樣品未呈現(xiàn)與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰，5批呈現(xiàn)與馬皮源特征峰保留時(shí)間一致的色譜峰，10批呈現(xiàn)與牛皮源特征峰保留時(shí)間一致的色譜峰，5批呈現(xiàn)與豬皮源特征峰保留時(shí)間一致的色譜峰，部分批次樣品表現(xiàn)為多種特征峰摻雜。

2.6.2 鉻（Cr）含量檢測(cè)

《阿膠中鉻（Cr）含量檢查的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》規(guī)定，阿膠中鉻含量應(yīng)≤2.0 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥品阿膠中鉻含量為0.077～0.442 mg/kg；食品（保健食品）阿膠中鉻含量為0.103～1.230 mg/kg；阿膠糕中鉻的含量為0.000～2.230 mg/kg，其中有1批超出限度要求。

3 結(jié)論

通過(guò)本次風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)專項(xiàng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目設(shè)置合理，能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，新增特征多肽的含量測(cè)定能杜絕雜皮源的摻入；藥品阿膠及阿膠珠總體質(zhì)量狀況較好，未發(fā)現(xiàn)摻偽造假情況；食品（保健食品）阿膠特別是阿膠糕總體質(zhì)量狀況較差，存在以雜皮、劣質(zhì)皮投料生產(chǎn)的情況。建議生產(chǎn)企業(yè)積極參加技術(shù)培訓(xùn)，加強(qiáng)原藥材的采購(gòu)、使用管理，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)；監(jiān)管部門加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)督檢查，針對(duì)雜皮投料問(wèn)題，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查，從源頭控制產(chǎn)品的質(zhì)量。