鄭曉艷

（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，福建漳州 363000）

白鳳菜為菊科（Compositae）菊三七屬（Gynura）多年生草本植物白鳳菜（GynuraformosanaKitam.）的全草，別名白擔(dān)當(dāng)，俗名肝炎草，其地上部分在福建特別是閩南民間被廣泛應(yīng)用，常作為消除各種炎癥、養(yǎng)護(hù)肝臟的民間草藥，是極具研究和開發(fā)價(jià)值的天然中草藥。白鳳菜性涼、味甘淡、無(wú)毒，入肝、肺、腎、大小腸等經(jīng)，具有解熱、解毒等功效[1]。目前對(duì)白鳳菜的研究集中在藥理活性方面，對(duì)白鳳菜質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和提取工藝研究的文獻(xiàn)較少。

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗肝臟毒性、抗心腦血管疾病、抗炎、抗氧化、降血糖等[2]。黃酮類化合物是白鳳菜的主要活性成分之一，其提取量可作為白鳳菜活性成分提取工藝優(yōu)劣對(duì)比的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。

本研究通過(guò)單因素、正交實(shí)驗(yàn)對(duì)白鳳菜總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬制定出操作便捷、重現(xiàn)性好的白鳳菜總黃酮提取工藝方案，為將來(lái)進(jìn)一步開發(fā)利用白鳳菜提供重要實(shí)驗(yàn)參考。

本文中白鳳菜總黃酮提取量的測(cè)定方法參考《中國(guó)藥典》及各類文獻(xiàn)，選用了簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確度高的金屬離子絡(luò)合法——NaN02-Al(N03)3-Na0H絡(luò)合法，可以普遍應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP225D型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；100SP型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海申生科技有限公司。

白鳳菜藥材采摘于福建漳州市薌城區(qū)，經(jīng)鑒定為菊科菊三七屬白鳳菜的地上部分。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白鳳菜前處理

將采摘的白鳳菜晾曬、40 ℃烘干至恒重，稱取20.0 g，加150 mL石油醚，索氏提取器中水浴加熱回流至提取液無(wú)色，徹底揮發(fā)石油醚，晾曬至干燥，保存待用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.108 4 g，用60%乙醇溶解并定容至50 mL，即得216.8 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于25 mL容量瓶中，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉、0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再各加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液5 mL，60%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置5 min，于510 nm處測(cè)定吸光度值[5]。以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，并求得回歸方程。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）乙醇濃度。精密稱取前處理后白鳳菜20 g，分別選擇20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比（g∶mL）為1∶20，90 ℃水浴提取1 h，提取2次，過(guò)濾除去藥渣，合并濾液，于65 ℃真空蒸發(fā)濃縮，檢測(cè)含量并計(jì)算提取量。

假定波浪載荷引起砂質(zhì)海床孔隙水的滲流滿足達(dá)西定律，滲透系數(shù)為常數(shù)，海床為各向同性介質(zhì)?；诒葕W動(dòng)力固結(jié)方程，海床的控制方程為：

（2）料液比。精密稱取前處理后白鳳菜20 g，以60%乙醇為提取溶劑，料液比（g∶mL）分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，90 ℃水浴提取1 h，提取2次，過(guò)濾除去藥渣，合并濾液，于65 ℃真空蒸發(fā)濃縮，檢測(cè)含量并計(jì)算提取量。

（3）提取時(shí)間。精密稱取前處理后白鳳菜20 g，以60%乙醇為提取溶劑，料液比（g∶mL）為1∶20，90 ℃水浴提取 1.0 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h，提取2次，過(guò)濾除去藥渣，合并濾液，于65 ℃真空蒸發(fā)濃縮，檢測(cè)含量并計(jì)算提取量。

（4）提取次數(shù)。精密稱取前處理后白鳳菜20 g，以60%乙醇為提取溶劑，料液比（g∶mL）為1∶20，90 ℃水浴提取1 h，分別提取1次、2次、3次、4次、5次，過(guò)濾除去藥渣，合并濾液，于65 ℃真空蒸發(fā)濃縮，檢測(cè)含量并計(jì)算提取量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以白鳳菜中總黃酮提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

表1 白鳳菜總黃酮L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 白鳳菜總黃酮提取量測(cè)定

將單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到的白鳳菜總黃酮用60%乙醇定容至50 mL，振搖均勻后靜置；精密移取1.0 mL試液于25 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉、0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再各加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液5 mL，以60%乙醇定容至刻度，振搖均勻，靜置5 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的含量，結(jié)果換算為白鳳菜干基含量（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以測(cè)得的吸光度值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸處理，求得回歸方程為Y=0.011 8X+0.004 1，R=0.999 9，線性范圍 8.672～ 60.704 μg/mL。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.24%，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD=0.69%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD=0.35%，證明該實(shí)驗(yàn)操作方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。平均加樣回收率98.1%，RSD=0.8%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取量的影響

經(jīng)查閱文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇成本低廉、安全無(wú)毒、易得、易回收的乙醇作為提取溶劑。乙醇溶度過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致水溶性（蛋白質(zhì)、多糖等）成分析出過(guò)多，搶占了總黃酮溶出空間，且蛋白質(zhì)和多糖易使提取液黏稠，總黃酮易被吸附；乙醇濃度過(guò)大則脂溶性成分更易析出，白鳳菜中一些水溶性黃酮類成分提取不完全，也會(huì)導(dǎo)致總黃酮的提取量較低。

從圖2可以看出，乙醇濃度對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響較大，在20%～60%內(nèi)，隨著乙醇濃度增加，白鳳菜總黃酮提取量快速上升；當(dāng)乙醇濃度大于60%后，增速開始趨于平穩(wěn)，甚至乙醇濃度超過(guò)80%后，白鳳菜總黃酮提取量有降低趨勢(shì)。故選擇乙醇濃度為40%、60%、80%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響

2.2.2 料液比對(duì)提取量的影響

從圖3可以看出，料液比對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響不大，雖然提取量隨著料液比減小略有上升，但總體平緩?？紤]到溶劑過(guò)少時(shí)不能完全浸沒(méi)藥材，且提取溶劑的用量過(guò)少，料液與藥材的有效成分濃度差過(guò)低，這兩方面均會(huì)導(dǎo)致總黃酮提取不完全，故溶劑不能過(guò)少。溶劑過(guò)多成本也隨之提高，考慮到提取成本，選擇1∶10、1∶20、1∶30為正交水平。

圖3 料液比對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響

白鳳菜總黃酮提取量在1～3 h隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；但當(dāng)外界溶劑未更換時(shí)，藥材組織內(nèi)外有效成分濃度差逐漸減少，直至達(dá)到內(nèi)外濃度平衡物質(zhì)幾乎不再溶出，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間不僅不能增加白鳳菜總黃酮提取量，反而導(dǎo)致有效物質(zhì)被破壞。故選擇提取時(shí)間為1 h、2 h、3 h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響

如圖5所示，提取次數(shù)從1次增加到2次，白鳳菜總黃酮提取量大幅增加，提取次數(shù)為3次及以上后，提取量增長(zhǎng)明顯趨于平緩，表示白鳳菜中的總黃酮已大部分被提取出?？紤]到增加提取次數(shù)會(huì)導(dǎo)致人員成本、能源消耗增加，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白鳳菜總黃酮提取量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，方差分析結(jié)果如表4所示。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 白鳳菜總黃酮提取工藝的方差分析表

從K值分析可知，最優(yōu)組合為A2B3C1D3，從正交結(jié)果看，最優(yōu)組合為A2B3C1D2。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出，提取次數(shù)從1次增加到2次，白鳳菜總黃酮提取量大幅增加，提取次數(shù)大于2次后，提取量增長(zhǎng)明顯趨于平緩，對(duì)提取量影響很小，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)成本，多提取一次所得量少，但能源、人工等消耗顯著增加，故白鳳菜總黃酮的提取次數(shù)確定為2次。從白鳳菜總黃酮提取工藝的方差分析表可知，對(duì)白鳳菜總黃酮提取量的影響大小順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取次數(shù)＞料液比。其中，提取時(shí)選用的乙醇濃度對(duì)白鳳菜總黃酮的提取量具有顯著影響（P＜0.05）。因此，綜合各因素考慮白鳳菜總黃酮最佳提取工藝為選用濃度為60%乙醇溶液提取，料液比1∶30（g∶mL），每次提取1 h，每份提取2次。

2.4 工藝驗(yàn)證

為驗(yàn)證該白鳳菜總黃酮提取工藝的效果，按上述優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，平行操作3份，分別計(jì)算總黃酮提取量。結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝下，白鳳菜總黃酮平均提取量為23.7 mg/g，RSD為0.86%，說(shuō)明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

本研究采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選得到白鳳菜總黃酮提取量影響因素大小順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取次數(shù)＞料液比。優(yōu)選出的白鳳菜總黃酮提取工藝為：選用60%乙醇提取，料液比1∶30（g∶mL），每次提取1 h，每份提取2次。在此最佳提取工藝條件下，白鳳菜總黃酮平均提取量為23.7 mg/g，RSD為0.86%，說(shuō)明該提取工藝穩(wěn)定、可行。