鄒偉，李夢圓，唐秀琴，楊慶紅，常巍

（昆明醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南昆明 650500）

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）對食物和病原體產(chǎn)生的各種氣味劑表現(xiàn)出趨化效應(yīng)，土壤中生活的秀麗隱桿線蟲具有12對纖毛結(jié)構(gòu)化感神經(jīng)元用于感知化學(xué)物質(zhì)[1]。通過嗅覺神經(jīng)元AWA、AWB和AWC檢測嗅覺信號，其中AWA和AWC檢測吸引性揮發(fā)化合物，AWB神經(jīng)元感應(yīng)排斥性揮發(fā)化合物[2]。線蟲神經(jīng)元感知趨化物質(zhì)具有特異性，如AWA和AWC神經(jīng)元受體ODR-10特異性感知吸引性物質(zhì)二乙酰[3]。

AWA與AWC的嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相似，即特定信號分子對其配體作出反應(yīng)，激活下游效應(yīng)分子。在AWC神經(jīng)元中，環(huán)核苷酸門控通道TAX-2/TAX4轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein Coupled Receptors，GPCR）下游的信號[4]；AWA的轉(zhuǎn)導(dǎo)則是通過TRPV通道OSM-9/OCR-2[5]。

辛硫磷是一種高效低毒的有機(jī)磷殺蟲劑，通過抑制蟲體內(nèi)膽堿酯酶的活性抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，導(dǎo)致蟲體麻痹而死亡。同時，辛硫磷對一些寄生蟲宿主的膽堿酯酶活力具有抑制作用，增強(qiáng)宿主胃腸蠕動，加速蟲體排出體外。辛硫磷殺蟲譜廣、應(yīng)用簡單，對多種鱗翅目幼蟲防治效果較好[6]。研究發(fā)現(xiàn)，辛硫磷是一種具有揮發(fā)性氣味的殺蟲劑。秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出對不同濃度的辛硫磷的趨化作用。作為揮發(fā)性信號，線蟲通過AWA或AWC何種受體感知，感知后如何進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有待闡明。本研究旨在探討線蟲感知辛硫磷揮發(fā)性氣味的機(jī)制，為高效殺蟲農(nóng)藥的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

50%辛硫磷，LR級，山東埃森化學(xué)有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒，北京天根生物科技公司；SYBR Green，北京聚合美生物有限公司；qPCR引物，上海生工生物工程有限公司；疊氮化鈉，分析純，美國Sigma-Aldrich；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），分析純，上海生工生物工程有限公司；氨芐青霉素（AMP），分析純，上海生工生物工程有限公司。

Allegra X-30R低溫高速離心機(jī)，美國貝克曼公司；TD-600低速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；Light Cycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；TSX超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific；Boxun超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 線蟲品系和培養(yǎng)基

線蟲品系為N2，線蟲干擾株包括odr-1、odr-7、str-2、odr-10、str-7、str-112、str-193、odr-3、gpa-2、gpa-3、gpa-13、gsa-1、goa-1、kin-2、pde-1、daf-11和odr-1基因干擾HT115細(xì)菌株。

NGM培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g、氯化鈉3.0 g、氯化鈣0.11 g、硫酸鎂0.12 g、膽固醇0.005 g、磷酸二氫鉀3.4 g、瓊脂17.0 g，蒸餾水1 L。

Sbasal緩沖液：100 mmol/L氯化鈉，0.01 mmol/L膽固醇，50 mmol/L磷酸鉀（pH 6.0）。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，蒸餾水1 L。

秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)于接種了大腸桿菌（Escherichia coli）OP50的NGM平板上，20 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3 趨化實(shí)驗(yàn)

趨化性實(shí)驗(yàn)在9 cm固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行。線蟲在接種OP50的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟期，用Sbasal緩沖液洗滌數(shù)次，放置于準(zhǔn)備好的趨化性測定板上。待線蟲散開后，在趨化板背面標(biāo)記兩個點(diǎn)，一個標(biāo)記點(diǎn)準(zhǔn)確滴加1 μL辛硫磷（10-1、10-2、10-3稀釋度）和1 μL疊氮化鈉（1 mol/ L），另一標(biāo)記點(diǎn)準(zhǔn)確滴加1 μL水和1 μL疊氮化鈉（1 mol/L）作為對照。在辛硫磷和對照物等距中心添加大約100條成熟期線蟲（圖1），加入1 h后，計(jì)算趨化指數(shù)，每組設(shè)3個平行樣，試驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 趨化實(shí)驗(yàn)示意圖

趨化指數(shù)=（辛硫磷處的線蟲數(shù)量-對照處線蟲數(shù)量）/線蟲總數(shù)

1.4 RNAi干擾實(shí)驗(yàn)

-80 ℃超低溫冰箱中將干擾細(xì)菌株取出劃線于含有100 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB平板上活化，培養(yǎng)過夜。挑取單克隆干擾細(xì)菌至含100 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放到搖床中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)過夜。取300 μL菌液加到含1 mmol/L IPTG和100 μg/mL氨芐青霉素抗性的NGM培養(yǎng)基上，超凈工作臺里吹干，25 ℃培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)小RNA的生成，達(dá)到干擾降低該基因表達(dá)的目的。平板培養(yǎng)完成后，將L1線蟲接種于平板上，待線蟲生長至young adult階段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 qPCR實(shí)驗(yàn)

線蟲在接種OP50的NGM培養(yǎng)基中20 ℃下培養(yǎng)至young adult，用S basal緩沖液洗滌數(shù)次，并置于趨化測定板上；滴加5 μL辛硫磷于無菌棉上，并用雙面膠固定于板蓋上，翻轉(zhuǎn)蓋子蓋住底部，用封口膜封實(shí)。1 h后收集線蟲，按標(biāo)準(zhǔn)程序提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以act-1為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計(jì)算辛硫磷處理組較對照組基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，引物序列見表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，應(yīng)用GraphPad Prism 8.4.0繪圖和數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷的趨化性依賴于AWC神經(jīng)元

前期研究發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL及5.0 μg/mL辛硫磷暴露，線蟲死亡率分別為17%、28%、52%和76%，均有較強(qiáng)殺滅效應(yīng)（圖2A），同時發(fā)現(xiàn)不同濃度辛硫磷對線蟲有較強(qiáng)趨化效應(yīng)。

為了確定辛硫磷的最佳趨化濃度，通過水稀釋辛硫磷建立10-1、10-2和10-33個濃度梯度。通過趨化實(shí)驗(yàn)檢測3個稀釋度線蟲的趨化效應(yīng)分別為0.46、0.52和0.10，稀釋度為10-2時趨化指數(shù)最高（圖2B），因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該稀釋液。

兩對化感神經(jīng)元AWA和AWC是感知揮發(fā)性趨化物的關(guān)鍵神經(jīng)元，odr-1和odr-7基因突變分別導(dǎo)致AWC和AWA神經(jīng)元功能障礙。為了確定傳遞辛硫磷信號的神經(jīng)元，檢測了odr-1和odr-7 RNAi線蟲的趨化指數(shù)。與野生型線蟲（N2）趨化指數(shù)0.53相比，odr-1 RNAi趨化指數(shù)下降為0.12（P＜0.05），趨化反應(yīng)明顯缺陷；odr-7基因干擾，趨化正常（圖2C）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AWC神經(jīng)元對辛硫磷的感知至關(guān)重要。

圖2 介導(dǎo)線蟲對辛硫磷趨化反應(yīng)的神經(jīng)元鑒定

2.2 G蛋白偶聯(lián)受體str-112對辛硫磷信號具有特異性反應(yīng)

據(jù)報(bào)道，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）STR-2和odr-10定位于AWC和AWA的神經(jīng)元，分別在感知2-庚酮和雙乙酰中發(fā)揮作用[5]。此外，一些候選gpcr，如str-7、str-112、str-193等被預(yù)測為潛在的化學(xué)品受體[7]。

為了檢測參與感知辛硫磷的GPCR，分別干擾str-2、odr-10、str-7、str-112和str-193基因表達(dá)，檢測線蟲趨化行為。如圖3A所示，str-2、odr-10、str-7和str-193基因干擾后趨化無明顯變化，str-112基因干擾后趨化降為0.13（P＜0.05）。

為了檢測趨化過程中GPCR蛋白的表達(dá)情況，通過 qPCR檢測 str-2、odr-10、str-7、str-112和 str-193基因轉(zhuǎn)錄水平。如圖3B所示，str-2、odr-10基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，str-7、str-193基因轉(zhuǎn)錄水平分別降低為0.02和0.25（P＜0.05），str-112基因轉(zhuǎn)錄水平則升高0.79倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，線蟲通過STR-112感知辛硫磷揮發(fā)性氣味信號，在感知過程中STR-7、STR-193轉(zhuǎn)錄受到抑制，STR-112轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。

圖3 參與辛硫磷感知的GPCR鑒定

2.3 Gα參與線蟲對辛硫磷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

當(dāng)GPCR接收到揮發(fā)性氣味等細(xì)胞外信號后，信號傳遞至下游信號傳感器G蛋白。G蛋白是由α、β和γ亞基組成的異聚體蛋白復(fù)合物，α亞單位的激活負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。在秀麗隱桿線蟲中，至少有6個Gα亞單位在AWC神經(jīng)元中表達(dá)，分別為odr-3、gpa-2、gpa-3、gpa-13、gsa1 和 goa-1。

通過odr-3、gpa-2、gpa-3、gpa-13、gsa-1和goa-1的RNAi實(shí)驗(yàn)篩選負(fù)責(zé)辛硫磷感知的Gα亞單位。如圖4A所示，odr-3、gpa-2、gpa-3和gpa-13基因的干擾對趨化反應(yīng)無顯著影響；gsa-1和goa-1基因干擾導(dǎo)致對辛硫磷趨化性缺陷，趨化指數(shù)降為0.24（P＜0.05）。

為了檢測趨化過程中Gα表達(dá)情況，通過qPCR檢測 odr-3、gpa-2、gpa-3、gpa-13、gsa-1和goa-1基因轉(zhuǎn)錄水平。如圖4B所示，odr-3、gpa-2、gpa-3和gpa-13基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，gsa-1和goa-1基因轉(zhuǎn)錄水平分別升高1.51倍和2.58倍（P＜0.05），說明線蟲通過GSA-1和GOA-1傳導(dǎo)辛硫磷揮發(fā)性氣味信號。

圖4 參與線蟲對辛硫磷感知的Gα篩選

2.4 辛硫磷趨化的下游級聯(lián)信號

當(dāng)配體結(jié)合且GPCR和Gα蛋白被激活時，可觸發(fā)信號級聯(lián)中下游信使的激活，如細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸（cAMP或cGMP）、肌醇1,4,5-三磷酸二酰甘油（DAG）和細(xì)胞質(zhì)鈣。為了闡明AWC神經(jīng)元中負(fù)責(zé)辛硫磷嗅覺感知的信號通路，對鳥苷酸環(huán)化酶受體cGMP信號通路，包括編碼受體型鳥苷酸環(huán)化酶（DAF-11和ODR-1）、活化陽離子通道的兩個亞基（TAX-2和TAX-4）和腺苷酸環(huán)化酶受體cAMP（KIN-2和PDE-1）相關(guān)基因進(jìn)行RNAi干擾，檢測趨化指數(shù)。

如圖5A所示，kin-2和pde-1基因干擾，趨化指數(shù)無明顯變化；daf-11和odr-1基因干擾導(dǎo)致趨化指數(shù)下降為0.31和0.30（P＜0.05）；tax-2和tax-4基因干擾導(dǎo)致趨化指數(shù)下降為0.27和0.25（P＜0.05）。結(jié)果表明，GSA-1和GOA-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至鳥苷酸環(huán)化酶受體，激活第二信使cGMP信號，進(jìn)一步活化TAX-2/TAX-4門控通道（圖5B）。

圖5 辛硫磷趨化的下游級聯(lián)信號分析

3 結(jié)論

秀麗隱桿線蟲對揮發(fā)性物質(zhì)的感知依賴于GPCR將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，GPCR由一個大基因家族編碼，線蟲中一個神經(jīng)元可能表達(dá)多個功能獨(dú)立的化學(xué)受體。ODR-10是AWA中二乙酰的特異性受體，STR-7是AWA中2-乙基己醇的特異性受體，STR-2是AWC中2-庚酮的特異性受體，STR-193是AWC中吲哚的特異性受體[3,5,9]。因此，一個或多個特定神經(jīng)元上不同化學(xué)感受器的激活導(dǎo)致線蟲趨化或趨避行為。在AWC神經(jīng)元中，ODR-1作為跨膜鳥苷酸環(huán)化酶發(fā)揮作用，cGMP門控陽離子通道（TAX-2/TAX-4）由第二信使cGMP激活。辛硫磷嗅覺信號被線蟲受體STR-112接收，將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)。辛硫磷信號通過Gα GSA-1和GOA-1轉(zhuǎn)導(dǎo)至鳥苷酸環(huán)化酶受體，激活第二信使cGMP信號，進(jìn)一步活化TAX-2/TAX-4門控通道，完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。