李俊，陳蓓蓓，魏杰，廖朝選*

（1.貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽 550002；2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽 550014）

農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中至關(guān)重要，對保障作物的生長與產(chǎn)量有重要作用，自2013年起，我國農(nóng)藥的登記數(shù)量持續(xù)增長[1]。農(nóng)藥在田間施用后，其中很大一部分進(jìn)入環(huán)境，產(chǎn)生暴露風(fēng)險。據(jù)統(tǒng)計分析，除草劑是登記產(chǎn)品中主要的三大類別之一，登記量占比持續(xù)上升[2]。除草劑的大量或不當(dāng)使用，使得水環(huán)境受到不同程度的污染[3-4]。比如，除草劑莠去津會導(dǎo)致水中脊椎動物斑馬魚胚胎畸形[5]，10%(噁)唑酰草胺乳油、20%(噁)唑·滅草松微乳劑、20%(噁)唑·氰氟乳油對斑馬魚有中等及以上的毒性作用[6]；利谷隆會影響穗狀狐尾藻的莖長、根長、整株長度、鮮重及干重[7]；敵草隆會抑制大型溞的活動，同時對大型溞的初次生殖時間、總生殖胎數(shù)、體長和產(chǎn)幼溞數(shù)量等生物學(xué)指標(biāo)均有不良影響[8]。

乙氧氟草醚是美國羅姆-哈斯公司開發(fā)的含氟二苯醚類除草劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、選擇性好的特點(diǎn)。主要通過破壞雜草系統(tǒng)的透性，促進(jìn)乙烯的釋放，使得植物細(xì)胞生理功能紊亂，促使葉片或幼芽衰老、萎蔫直至死亡[9]。乙氧氟草醚對半夏、甘蔗、棉花等田間雜草具有良好的防效，而且對相應(yīng)作物安全，目前已在大蒜、甘蔗、柑橘和水稻等20個作物上進(jìn)行雜草防治登記[10-13]。然而，乙氧氟草醚對水生生物具有一定的毒性，會影響大鱗副泥鰍血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力值，同時會造成DNA損傷，高劑量下還會導(dǎo)致死亡，長期大量使用可能造成水生態(tài)系統(tǒng)的破壞[14]。

評價除草劑對水生生物的毒性效應(yīng)是農(nóng)藥風(fēng)險評估的重要組成部分，是我國農(nóng)藥登記必須通過的環(huán)節(jié)。目前，對于乙氧氟草醚的水生生物毒性研究較少，本文選取標(biāo)準(zhǔn)模式生物斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻，結(jié)合相關(guān)評價標(biāo)準(zhǔn)開展急性毒性研究，為乙氧氟草醚的風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JY5002電子天平，感量0.000 1 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SG9溶解氧測定儀，梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；PHS-3C pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PRX-250B智能人工氣候培養(yǎng)箱，上海比朗儀器制造有限公司；8L一體成型玻璃方缸，市售常規(guī)款式；S200藻類計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司。

3%乙氧氟草醚水乳劑，廣東茂名綠銀農(nóng)化有限公司；魚和溞試驗用水使用活性炭過濾并脫氯的自來水，pH在8左右，硬度（以CaCO3計）為150 mg/L，溶解氧為空氣飽和氧（ASV）的96%；藻試驗培養(yǎng)基，參考《農(nóng)藥登記環(huán)境試驗方法標(biāo)準(zhǔn)匯編（一）》（以下簡稱《導(dǎo)則》）[15]規(guī)定方法進(jìn)行配制。

1.2 試驗生物

斑馬魚（Brachydaniorerio），購自上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場，魚齡2月，全長2～3 cm，體重0.11～0.14 g。

大型溞（Daphniamagna），引自武漢科樂多生物科技有限公司，引入后于實(shí)驗室內(nèi)培養(yǎng)，收集24 h內(nèi)的幼溞用于試驗。

羊角月牙藻（Pseudokirchneriellasubcapitata），引自中國科學(xué)院淡水藻種庫，引入后于實(shí)驗室培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期的藻類進(jìn)行試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚類急性毒性試驗

參考《導(dǎo)則》[15]，將3%乙氧氟草醚水乳劑用去離子水溶解，用試驗水稀釋制備為有效成分含量0.008 mg/L、0.014 mg/L、0.025 mg/L、0.044 mg/L 和0.080 mg/L的梯度試驗溶液，并設(shè)置一個空白對照組。試驗環(huán)境條件為（24±1）℃、溶解氧＞60%ASV、pH6.0～8.5、光暗比為16 h/8 h，每日觀察并記錄試驗魚發(fā)生毒性效應(yīng)及死亡情況，試驗周期96 h。

1.3.2 溞類活動抑制試驗

與魚類急性毒性試驗相似，將3%乙氧氟草醚水乳劑用去離子水溶解后，用試驗水稀釋制備為有效成分含量0.024 mg/L、0.029 mg/L、0.035 mg/L、0.042 mg/L、0.050 mg/L、0.060 mg/L的五個處理濃度，并設(shè)置一個空白對照組。添加試驗幼溞后，于（20±1）℃、pH為6～9、溶解氧＞60%ASV、避光條件下開展試驗。每個處理設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)使用5只試驗溞。在48 h內(nèi)每日觀測記錄大型溞受抑制的情況。

1.3.3 藻類生長抑制試驗

參照藻類生長抑制試驗方法[15]，先對羊角月牙藻藻種進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)藻細(xì)胞數(shù)量和擬制備試驗液濃度，用藻試驗培養(yǎng)基將羊角月牙藻藻種稀釋至2×104個/mL的藻液備用。然后取3%乙氧氟草醚水乳劑，用上述制備的藻液稀釋為有效成分含量0.10 μg/L、0.16 μg/L、0.26 μg/L、0.41 μg/L、0.66 μg/L 和1.05 μg/L的處理組試驗液，然后置于（23±1）℃、持續(xù)光強(qiáng)6 000 Lx的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行試驗。試驗同時設(shè)置不添加供試農(nóng)藥的空白對照，每組設(shè)3個重復(fù)，在72 h內(nèi)每日觀察并記錄藻類的生長情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)觀察的毒性測試結(jié)果，采用Origin 2019b進(jìn)行濃度-效應(yīng)曲線擬合，采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析LC50/EC50與95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒性效應(yīng)

在魚類急性毒性試驗中，試驗承載量為0.45 g/L，溫度23.1～24.3 ℃，pH 7.53～7.64，溶解氧83.7%～97.8%ASV，對照組試驗魚死亡率為0%。經(jīng)3%乙氧氟草醚水乳劑暴露后，斑馬魚發(fā)生體色變黑、游動緩慢、反應(yīng)遲鈍、頻繁換氣癥狀，嚴(yán)重者發(fā)生死亡。

溞類活動抑制試驗的溫度19.3～20.6 ℃，pH 7.30～7.75，溶解氧為85.2%～97.5%ASV，滿足大型溞正常生長需求，對照組溞死亡率為0%，符合試驗要求。經(jīng)3%乙氧氟草醚水乳劑暴露后，大型溞發(fā)生游動無力現(xiàn)象，在輕微晃動試驗容器下，部分大型溞15 s內(nèi)無法游動，嚴(yán)重者發(fā)生死亡。

使用羊角月牙藻測試3%乙氧氟草醚水乳劑對藻類的毒性效應(yīng)，試驗中溫度22.4～23.5 ℃，對照組藻濃度從初始的2×104個/mL增長至1.8×106個/mL。藻細(xì)胞呈指數(shù)增長，試驗周期內(nèi)共計增長89倍，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的增長倍數(shù)≥16倍要求，試驗條件和程序滿足羊角月牙藻正常生長需要，試驗藻類適宜開展毒性研究。研究表明，3%乙氧氟草醚水乳劑不會引起藻類形態(tài)改變，但對藻細(xì)胞生長量和特定生長率均有顯著的影響。

2.2 50%效應(yīng)濃度與毒性等級

如圖1所示，斑馬魚和大型溞分別暴露于不同濃度的3%乙氧氟草醚水乳劑后，發(fā)生了不同程度的致死或活動抑制效應(yīng)，其致死率或活動抑制率與濃度具有線性相關(guān)性，隨3%乙氧氟草醚水乳劑濃度增大，死亡率或活動抑制率增高。羊角月牙藻在0.10～1.05 mg/L的3%乙氧氟草醚水乳劑中暴露后，生長量和生長率受到不同程度的抑制，在不同濃度段抑制率增大幅度不同。

圖1 不同濃度3%乙氧氟草醚水乳劑對3種水生生物的抑制率

如表1所示，通過SPSS 17.0統(tǒng)計分析，3%乙氧氟草醚水乳劑對斑馬魚的96 h的半致死濃度LC50為0.072 6 mg/L，95%置信限為0.055 3～0.098 3 mg/L；對大型溞48 h的50%效應(yīng)濃度EC50為0.047 5 mg/L，95%置信限為0.043 7～0.051 7 mg/L；對羊角月牙藻生長量的72 h的50%效應(yīng)濃度EyC50為0.194 mg/L，95%置信限為0.150～0.239 mg/L；對羊角月牙藻生長率抑制的50%效應(yīng)濃度ErC50為0.359 mg/L，95%置信限為0.326～0.397 mg/L。

表1 3%乙氧氟草醚水乳劑對3種水生生物的毒性試驗結(jié)果

根據(jù)《導(dǎo)則》[15]要求，農(nóng)藥對魚類、溞類、藻類的毒性判定分別以毒性終點(diǎn)LC50（96 h）、EC50（48 h）、ErC50/EyC50（72 h）確定。（1）當(dāng)魚類（LC50）或溞類（EC50）的毒性終點(diǎn)＞10時，毒性為低毒；1.0＜LC50（EC50）≤10時，毒性為中毒；0.1＜LC50（EC50）≤1.0時，毒性為高毒；LC50（EC50）≤0.1時，毒性為劇毒。（2）對于藻類的生長抑制試驗，毒性等級分為三級。當(dāng)毒性終點(diǎn)EC50＞3.0時，毒性為低毒；0.3＜EC50≤3.0時，毒性為中毒；EC50≤0.3時，毒性為高毒。根據(jù)測試結(jié)果，3%乙氧氟草醚水乳劑對斑馬魚的96 h半致死濃度LC50＜0.1 mg/L，毒性等級為劇毒；對大型溞的48 h 50%活動抑制效應(yīng)EC50＜0.1 mg/L，毒性等級為劇毒；對羊角月牙藻生長量的72 h 50%抑制效應(yīng)EC50＜0.3 mg/L，毒性為高毒。

3 結(jié)論

在實(shí)驗室條件下，利用靜態(tài)試驗法測定了3%乙氧氟草醚水乳劑對斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻三種不同生態(tài)位水生生物的急性毒性。試驗中環(huán)境條件與對照組的死亡率或抑制效應(yīng)均符合相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)要求，試驗結(jié)果可靠。通過測試分析，3%乙氧氟草醚水乳劑對三種水生生物均有毒性效應(yīng)，其對斑馬魚（LC50）、大型溞（EC50）、羊角月牙藻（ErC50/EyC50）的50%毒性效應(yīng)濃度分別為0.072 6 mg/L、0.047 5 mg/L、0.194/0.359 mg/ L，毒性等級分別為劇毒、劇毒、高毒。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)離不開農(nóng)藥的使用，科學(xué)、安全地使用農(nóng)藥可減少對生態(tài)環(huán)境的破壞。3%乙氧氟草醚水乳劑對試驗所選的三種水生生物都有較高的毒性，在稻-魚、稻-蝦、稻-蟹等生態(tài)漁業(yè)中應(yīng)禁止使用，以防產(chǎn)品在田水中殘留，影響漁業(yè)生產(chǎn)；產(chǎn)品包裝物在河流或湖泊等水域隨意丟棄或清洗，或施藥時漂移至水體，仍然可導(dǎo)致較高的生態(tài)風(fēng)險，在實(shí)際應(yīng)用過程中需要嚴(yán)格注意。此外，農(nóng)藥對環(huán)境生物的毒性僅僅是影響風(fēng)險水平中的一個重要因素，它還與農(nóng)藥自身的性質(zhì)和環(huán)境中的行為特性有關(guān)，同時環(huán)境中生物種類繁多，還需結(jié)合更多種類生物的毒性進(jìn)行全面的評估。