郎超

（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原 030031）

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種廣泛存在于花生、葡萄等植物中的天然多酚類化合物，是植物在受到外界刺激時(shí)自身合成的一種植物抗毒素，可用于對(duì)抗外傷、細(xì)菌、感染、紫外線等外界壓力。1940年，日本人Tokaoka首次從毛葉藜蘆的根中分離得到白藜蘆醇，目前多項(xiàng)研究表明白藜蘆醇具有抗氧化、改善微循環(huán)、抗炎等廣泛的生物活性和藥理學(xué)特性[1-3]。

近年來的研究還證實(shí)白藜蘆醇能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種靶點(diǎn)和信號(hào)途徑表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用[4-7]。PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝、侵襲等活動(dòng)，故其在腫瘤細(xì)胞中常會(huì)過度表達(dá)或被異常激活[8]。白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控下游分子影響細(xì)胞的增殖[9]。因此，本研究選取PI3K/Akt信號(hào)通路研究白藜蘆醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116凋亡的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白藜蘆醇、DMSO、MTT試劑，Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；F-12/DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；1%青-鏈霉素，北京索萊寶科技有限公司；10%胎牛血清，生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3、PI3K、Akt和β-actin抗體，美國CST公司；Bcl-2、Bax抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

Galaxy 170 S二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國FINEPCR公司；Infinite F50型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BD FACSCalliburⅡ型流式細(xì)胞儀，美國BD公司；PowerPac HC型電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116（人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞株）接種于加有10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的F-12/DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、濕度飽和及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況定時(shí)換液。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)接種于96孔板中，觀察其貼壁后，設(shè)置對(duì)照與不同濃度（25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）的白藜蘆醇組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別孵育12 h、24 h、36 h后取出，每孔更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入20 μL MTT（5.0 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。于避光環(huán)境下，棄去培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL，低速震蕩10 min。

使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)得各孔的吸光度。按照公式（1）計(jì)算不同濃度白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

式中，At為t實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值，A0為對(duì)照組吸光度平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

選取對(duì)數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，觀察其貼壁后，設(shè)置對(duì)照與不同濃度（50 μmol/L、100 μmol/L）的白藜蘆醇組，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管中，加Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光染色15 min；加入 1×結(jié)合緩沖液400 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC熒光通道為FL1-H，PI熒光通道為FL2-H，獲取細(xì)胞數(shù)量為15 000個(gè)/樣，不足15 000個(gè)收取全部細(xì)胞；最后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo 10.8.1軟件分析，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡百分率。

1.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)

將不同濃度白藜蘆醇處理過的HCT-116細(xì)胞收集起來，裂解提取蛋白，BCA法測(cè)得蛋白濃度后制樣。取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。接對(duì)應(yīng)蛋白一抗4 ℃孵育過夜，接二抗室溫孵育2 h。將雜交膜上多余抗體清洗干凈后，滴加發(fā)光液曝光定影，條帶記錄相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。以β-Actin作為內(nèi)參，用Image J 1.8.0進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用

通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了白藜蘆醇對(duì)HCT-116是否存在增殖抑制效應(yīng)，如圖1所示。與對(duì)照組相比，隨著作用時(shí)間的延長及白藜蘆醇濃度的增大，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，且各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制存在濃度和時(shí)間依賴。

圖1 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響

2.2 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞是否存在促凋亡效應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組HCT-116細(xì)胞的凋亡率為2.61%（早期凋亡0.54%，晚期凋亡2.07%）；實(shí)驗(yàn)組隨白藜蘆醇濃度增高，HCT-116細(xì)胞凋亡率增加，50 μmol/L和 100 μmol/L白藜蘆醇組HCT-116細(xì)胞凋亡率分別為16.80%（14.70%+2.10%）、43.98%（39.10%+4.88%），分別較對(duì)照增加14.19個(gè)百分點(diǎn)和41.37個(gè)百分點(diǎn)。結(jié)果表明，白藜蘆醇可有效促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

2.3 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

經(jīng) 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 白藜蘆醇處理24 h后，HCT-116細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況如圖3所示，Akt、PI3K的表達(dá)量如圖4所示?；叶确治鼋Y(jié)果表明（圖5），與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HCT-116細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），Bax的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），且呈濃度依賴關(guān)系。與對(duì)照組相比，p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K比值均顯著降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PI3K/Akt通路的激活對(duì)下游的抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax有明顯影響[10]，Bcl-2和Bax之間的平衡對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控起關(guān)鍵作用[11]。說明白藜蘆醇有效抑制了PI3K/Akt通路的激活，并影響促凋亡蛋白Bax高表達(dá)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，介導(dǎo)HCT-116的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)影響

圖4 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞內(nèi)Akt、PI3K蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

圖5 白藜蘆醇對(duì)HCT-116細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的灰度分析圖

3 結(jié)論

本研究初步探討了白藜蘆醇基于PI3K/Akt通路對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效上調(diào)Caspase-3和Bax的表達(dá)并下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，且其作用效果呈濃度和時(shí)間依賴性，為白藜蘆醇抗腫瘤機(jī)制的研究提供了新的參考。