劉朝陽(yáng),劉澤華,方艷艷,楊伯元

代森錳及其代謝物的神經(jīng)毒性影響與機(jī)制研究

劉朝陽(yáng)1,2,3*,劉澤華1,2,方艷艷1,2,楊伯元1,2

(1.中南財(cái)經(jīng)政法大學(xué)環(huán)境與健康研究中心,湖北 武漢 430073；2.中南財(cái)經(jīng)政法大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,湖北 武漢 430073；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院,湖北 武漢 430060)

以SH-SY5Y和PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?深入探討了代森錳(Maneb)及其代謝產(chǎn)物對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒性影響與機(jī)制.結(jié)果表明,Maneb的有機(jī)部分和金屬離子成分單獨(dú)暴露不具有明顯的毒性作用,聯(lián)合暴露具有協(xié)同效應(yīng),且對(duì)細(xì)胞活性的抑制程度與同一濃度水平的Maneb相當(dāng),其原因與誘導(dǎo)活性氧自由基生成、細(xì)胞凋亡相關(guān).此外,蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn),Maneb下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)Bax、細(xì)胞色素C的水平,同時(shí)激活Caspase-3,提示線粒體凋亡途徑在Maneb誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要作用.

代森錳；SH-SY5Y細(xì)胞；PC12細(xì)胞；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

代森錳(Maneb)是一種典型的二硫代氨基甲酸酯類(DTC)殺菌劑,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用范圍廣泛[1],主要用于蔬菜、果樹(shù)的種植,可防治各種炭疽病、霜霉病、黑星病、疫病和斑點(diǎn)等[2].隨著該產(chǎn)品生產(chǎn)量和使用量的增加以及使用范圍的擴(kuò)大,Maneb及其降解產(chǎn)物在地表水、飲用水、農(nóng)作物和食品中都可被檢出[3-6],其對(duì)人類健康和環(huán)境安全的影響日益受到人們的關(guān)注.

目前關(guān)于Maneb毒性效應(yīng)的研究表明其具有潛在的發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性.根據(jù)流行病學(xué)研究,在職業(yè)場(chǎng)景中單獨(dú)暴露于Maneb或者聯(lián)合暴露于Maneb和其它農(nóng)藥均能顯著增加帕金森病(PD)的患病風(fēng)險(xiǎn)[7-8].體內(nèi)研究表明,Maneb暴露可降低斑馬魚(yú)的生存能力和孵化率,并誘導(dǎo)脊索畸形導(dǎo)致發(fā)育毒性,而高濃度的Maneb暴露可產(chǎn)生神經(jīng)毒性,使斑馬魚(yú)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)功能障礙[3,9].此外,Maneb可特異性地誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元毒性損傷[10-11],且能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PD樣行為學(xué)和病理學(xué)改變[12],表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙、大腦紋狀體多巴胺水平下降等[13].而根據(jù)體外研究結(jié)果顯示,Maneb的神經(jīng)毒性機(jī)制研究集中在α-突觸核蛋白的聚集、蛋白質(zhì)硫醇烷基化、線粒體功能障礙、谷胱甘肽氧化導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等途徑[14-19].Maneb由Mn2+和有機(jī)配體乙二硫代氨基甲酸酯(EBDC)共同構(gòu)成,Maneb的溶液形式相對(duì)穩(wěn)定,但也可能降解為Mn2+和游離的EBDC[3].以往的研究發(fā)現(xiàn)使用Maneb處理細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中Mn2+的積累[20-22].此外,許多研究表明乙撐硫脲(ETU)是Maneb有機(jī)部分的主要降解和代謝產(chǎn)物[23-25].目前,Maneb的有機(jī)部分和金屬離子成分都已被證明具有潛在的毒性[20-21].然而Maneb針對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的主要毒性成分研究存在缺失,其致神經(jīng)細(xì)胞的毒性效應(yīng)和機(jī)制尚待闡明.

本研究選取Maneb及其代謝產(chǎn)物為研究目標(biāo),以多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞為模型,從細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)生成、細(xì)胞凋亡水平來(lái)評(píng)價(jià)各毒素成分的單獨(dú)和聯(lián)合毒性效應(yīng),從而探討Maneb的主要毒性成分.此外,通過(guò)檢測(cè)不同濃度梯度Maneb處理下,細(xì)胞中線粒體凋亡途徑關(guān)鍵蛋白如Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平,以深入研究線粒體凋亡途徑在Maneb暴露致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,從而為進(jìn)一步研究Maneb誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 化學(xué)試劑 Maneb、代森鈉(Nabam)、ETU均購(gòu)自阿爾塔科技有限公司(1ST21098, 1ST21096, 1ST21100, 1ST24013),MnCl2購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司(M813486).Cell Counting KIT-8 (CCK-8)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(CK04);活性氧測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司(E004-1-1);細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(C1056);Bax抗體、Cytochrome C抗體購(gòu)于Abcam公司(ab32503, ab133504), Bcl-2抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司(10571T),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、Caspase-3抗體購(gòu)于Proteintech公司(HRP- 60004, 19677-1-AP).

1.1.2 儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(HERAcell150i, Thermo Scientific);生物安全柜(HR40-IIA2, Haier);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiDocTMTouch, Bio-Rad Laboratories);倒置熒光顯微鏡(IX73, OLYMPUS);酶標(biāo)儀(SpectraMaxi3x, Molecular Devices).

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y和大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12由武漢大學(xué)生命科學(xué)院提供,使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素溶液),置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的暴露 使用二甲基亞砜(DMSO)溶解Maneb及其代謝產(chǎn)物,配置濃度為100mmol/L的儲(chǔ)存液于-80℃中保存, 10mmol/L的使用液于-20℃中保存,臨用前使用DMEM培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)處理濃度,并保證DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.1%.處理細(xì)胞時(shí),先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)基,加入含有設(shè)定濃度藥品的新培養(yǎng)基.根據(jù)以往的研究[15,21],本文使用Nabam和MnCl2分別模擬Maneb的有機(jī)主體和金屬離子成分.

1.2.2 細(xì)胞活性的檢測(cè) 使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性.將SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別接種于96孔板中,約1×104細(xì)胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用于實(shí)驗(yàn).根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,用不同濃度的毒素處理細(xì)胞,每個(gè)濃度至少設(shè)置3個(gè)重復(fù).處理24h后,棄培養(yǎng)基,每孔加入100μL的新培養(yǎng)基,再加入10μL的CCK-8溶液,在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后,在450nm波段用酶標(biāo)儀讀數(shù).

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè) 使用DCFH- DA探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平.將SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別接種于12孔板中,約1×105細(xì)胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用于實(shí)驗(yàn).針對(duì)不同的毒素,使用相同的濃度(20μmol/L)處理細(xì)胞,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù).在處理24h后,棄原培養(yǎng)基,加入500μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配置的濃度為10mmol/L的DCFH-DA染色液.在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育20～30min,使用PBS洗滌3次后,直接在熒光顯微鏡中觀察并拍照.

1.2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 使用Hoechst 33342/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死情況.將SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別接種于12孔板中,約1×105細(xì)胞/孔,在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用于實(shí)驗(yàn).處理方式和濃度與1.2.3相同,染色液使用試劑盒中的緩沖液配置,每800μL的染色緩沖液中,Hoechst染色液和PI染色液各加入5μL.在4℃條件下孵育20～30min,使用PBS洗滌一次后,在熒光顯微鏡下觀察并拍照.記錄細(xì)胞的Hoechst藍(lán)色熒光和PI紅色熒光圖,并將兩種熒光圖重疊得到Merge處理的圖片.

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 在細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別培養(yǎng)并用Maneb處理SH-SY5Y和PC12細(xì)胞24h,使用含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液(NP- 40Lysis Buffer)提取并溶解細(xì)胞內(nèi)蛋白,加入蛋白上樣緩沖液混合后,在100℃條件下煮沸10min制得蛋白樣.電泳時(shí),每孔上樣量為10μg,60V恒壓電泳60min后調(diào)至120V恒壓電泳30min,使用蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶常溫封閉1h,孵育一抗,4℃過(guò)夜.次日,用洗膜緩沖液(TBST)洗6次,室溫孵育二抗1h,再次用TBST洗膜6次后,在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光值和蛋白條帶灰度值均使用ImageJ軟件讀取分析.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS statistics 22.0完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并使用Graphpad Prism 8.0制作圖表,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,再使用單因素方差分析法比較各組之間的差異,以<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 Maneb及其代謝產(chǎn)物暴露下細(xì)胞形態(tài)變化觀察

A為SH-SY5Y細(xì)胞處理組;B為PC12細(xì)胞處理組;標(biāo)尺=25μm

使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2分別處理SH-SY5Y和PC12細(xì)胞,白光下觀察對(duì)細(xì)胞密度和形態(tài)的影響如圖1所示.處理濃度在20μmol/L以上時(shí),Maneb對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞都有明顯的損傷,主要表現(xiàn)在處理24h后細(xì)胞密度減小、貼壁率降低、細(xì)胞間隙增大且出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象.作為Maneb的主要代謝產(chǎn)物,ETU和MnCl2在處理濃度大于600μmol/L時(shí)會(huì)出現(xiàn)類似現(xiàn)象;對(duì)于與Maneb有機(jī)部分相同的Nabam,其處理濃度在200μmol/L以上時(shí)能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用.而將Nabam與MnCl2聯(lián)合暴露于細(xì)胞時(shí),在30μmol/L的處理濃度下便能損傷大量細(xì)胞,其毒性作用與Maneb相當(dāng).

2.2 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性

使用Maneb和Nabam分別處理SH-SY5Y和PC12細(xì)胞,通過(guò)CCK-8法檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞活性的影響,結(jié)果如圖2所示.Maneb濃度依賴性地影響細(xì)胞活力,隨著處理濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸減少.在濃度為20μmol/L時(shí),使用Maneb處理24h使細(xì)胞活力下降過(guò)半;Nabam在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響,處理濃度為400μmol/L時(shí)會(huì)使細(xì)胞活力大幅降低.

ETU、MnCl2以及Nabam與MnCl2聯(lián)合作用對(duì)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞活力影響如圖2所示.處理時(shí)間為24h,處理濃度低于200μmol/L時(shí),ETU和MnCl2的單一暴露對(duì)細(xì)胞活力的影響較小,其中MnCl2對(duì)細(xì)胞的刺激作用稍大于ETU.處理濃度低于200μmol/L時(shí),Nabam對(duì)細(xì)胞活力影響較小.而使用Nabam聯(lián)合MnCl2處理細(xì)胞時(shí),二者毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用,在20μmol/L的濃度條件下使細(xì)胞活力大幅下降,對(duì)細(xì)胞活力的影響遠(yuǎn)大于單一暴露.這與2.1中細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果一致.

圖2 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

A、B為SH-SY5Y細(xì)胞處理組;C、D為PC12細(xì)胞處理組

2.3 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞ROS水平的影響

在20μmol/L的濃度條件下,分別使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2處理SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞24h.如圖3所示,單一暴露處理中,Maneb處理組誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS與對(duì)照組及其他單一藥物處理組相比差異極顯著(<0.01).ETU和MnCl2處理組與對(duì)照組相比基本沒(méi)有差異,Nabam處理組能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生極少的ROS,與對(duì)照組相比有顯著差異(<0.05).聯(lián)合暴露中,Nabam與MnCl2的同時(shí)處理可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS,與Nabam和MnCl2單一處理組相比差異極顯著(<0.01),與Maneb單一處理誘導(dǎo)的ROS生成量相當(dāng),呈現(xiàn)協(xié)同作用.

圖3 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞ROS水平的影響

A、B分別為SH-SY5Y和PC12細(xì)胞ROS熒光圖;C為柱形統(tǒng)計(jì)圖

字母表示多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞暴露于20μmol/L濃度的各毒素產(chǎn)生ROS的差異性,字母相同代表差異性不顯著(>0.05),字母不同代表差異性顯著(<0.05);熒光圖標(biāo)尺=50μm

A、B分別為SH-SY5Y和PC12細(xì)胞凋亡熒光圖;C為柱形統(tǒng)計(jì)圖

字母表示多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞暴露于20μmol/L濃度的各毒素發(fā)生凋亡的差異性,字母相同代表差異性不顯著(>0.05),字母不同代表差異性顯著(<0.05);熒光圖標(biāo)尺=50μm

2.4 Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

與2.3的處理方式類似,在20μmol/L的濃度條件下,分別使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2處理SH-SY5Y和PC12細(xì)胞24h,Maneb及其代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響如圖4所示.對(duì)于單一暴露,在Maneb處理組中,細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組和其他處理組相比具有顯著差異,說(shuō)明Maneb可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且毒性顯著高于其代謝產(chǎn)物.對(duì)于Nabam和MnCl2的聯(lián)合暴露,其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平顯著高于Nabam和MnCl2單一暴露的結(jié)果,表明它們對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)也具有協(xié)同作用.

2.5 Maneb對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 Maneb對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

A、C分別為SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的WB條帶圖;B、D分別為A、C對(duì)應(yīng)的柱形統(tǒng)計(jì)圖

與對(duì)照組相比,*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001

在不同濃度的Maneb中暴露24h后,SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵生物標(biāo)志物Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cytochrome C (Cyt C)的蛋白表達(dá)水平的變化見(jiàn)圖5.與對(duì)照組相比,Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì),Bcl-2呈下降趨勢(shì),其變化程度與Maneb的暴露劑量呈正相關(guān).Maneb的處理濃度達(dá)10μmol/L以上時(shí),Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá)水平呈顯著上升,Bcl-2表達(dá)水平呈顯著下降.這些結(jié)果表明, Cyt C和Caspase-3可能在Maneb引起的細(xì)胞凋亡中起重要作用,而B(niǎo)ax和Bcl-2蛋白水平的改變也預(yù)示著線粒體凋亡途徑被激活.

3 討論

3.1 Maneb對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性的主要毒性成分

以往對(duì)于Maneb毒性作用的討論主要分為三類:一是金屬離子成分,尤其是Mn2+導(dǎo)致了細(xì)胞毒性.多項(xiàng)研究證實(shí),在體內(nèi)和體外模型中,使用Maneb處理后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)和體外模型中Mn2+濃度顯著增加[20,26-27].因此,Maneb有可能通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)的金屬濃度來(lái)破壞金屬穩(wěn)態(tài).Vaccari等[28]的研究表明,是Maneb的金屬離子成分Mn2+而非有機(jī)部分,抑制了腦突觸囊泡中的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.二是Maneb的有機(jī)部分而非金屬離子導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞毒性.Soleo等[29]發(fā)現(xiàn)代森錳鋅(Mancozeb)和代森鋅(Zineb, ZB)對(duì)于原代中腦細(xì)胞的毒性作用相當(dāng),從而支持了這一觀點(diǎn).三是Maneb的毒性可能是涉及有機(jī)部分和金屬離子成分的共同作用機(jī)制,這主要是通過(guò)研究Nabam和MnCl2聯(lián)合暴露的毒性來(lái)證實(shí)的[24,30].

本研究發(fā)現(xiàn)MnCl2在較高濃度下會(huì)抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性,但在與Maneb相同的處理?xiàng)l件下,MnCl2并未產(chǎn)生毒性效應(yīng),這與以往的研究結(jié)果相同.Carmona等[22]比較了不同存在形式的錳對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Maneb的毒性最大且顯著大于MnCl2和硫酸錳(MnSO4).Hoffman等[21]指出MnCl2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中的Mn顯著積累,但在Maneb的毒性濃度下并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性.另一項(xiàng)研究以結(jié)腸細(xì)胞為模型,發(fā)現(xiàn)Maneb毒性顯著大于與其有機(jī)部分相同的Zineb,而MnCl2的毒性與ZnCl2相當(dāng)[20],說(shuō)明決定Maneb毒性作用大小的并非金屬離子成分.

表1 EBDC類物質(zhì)及其降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

在毒性效應(yīng)層面上,本研究發(fā)現(xiàn)處理濃度為20μmol/L時(shí),在SH-SY5Y和PC12細(xì)胞中,Maneb可顯著誘導(dǎo)ROS的生成,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,但相同處理?xiàng)l件下MnCl2暴露并沒(méi)有產(chǎn)生毒性效應(yīng).Domico等[31]使用MnCl2處理大鼠中腦多巴胺能細(xì)胞和γ-氨基丁酸(GABA)能細(xì)胞時(shí),在相同濃度條件下,其產(chǎn)生的ROS遠(yuǎn)低于Maneb.這些結(jié)果表明Mn2+并不能完全解釋Maneb的細(xì)胞毒性,Maneb的有機(jī)部分在細(xì)胞毒性過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用.另外,由于Nabam有著與Maneb相同的核心有機(jī)成分,多項(xiàng)研究使用Nabam研究Maneb有機(jī)部分的毒性作用[20-21,24,31],結(jié)果與本研究一致,即Nabam僅在較高的濃度下才會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性.又因?yàn)镸aneb的有機(jī)部分會(huì)降解和代謝為ETU,本研究發(fā)現(xiàn)ETU對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞活性影響較小,在Maneb的毒性濃度下對(duì)細(xì)胞活性氧水平和細(xì)胞凋亡率并無(wú)影響,這與以往的研究結(jié)果類似[24,31].Maneb和ETU的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1.綜上,僅有機(jī)部分也不能完全解釋Maneb的細(xì)胞毒性作用.

本研究提出Maneb的有機(jī)部分和金屬離子成分的協(xié)同毒性效應(yīng),將細(xì)胞同時(shí)暴露于Nabam和MnCl2,以模擬Maneb的化學(xué)結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示,Nabam與MnCl2聯(lián)合暴露的毒性顯著高于此二種毒素單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí)的毒性,對(duì)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞活性的損傷效果與Maneb相近,在相同處理濃度下其導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生ROS的水平和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的水平與Maneb相當(dāng).Hoffman等[21]使用Nabam和MnCl2聯(lián)合處理結(jié)腸細(xì)胞時(shí),在與Maneb相同的濃度范圍內(nèi),導(dǎo)致了細(xì)胞存活率的降低,同時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化物水平與Maneb相近.這些數(shù)據(jù)都支持了Maneb的有機(jī)部分和金屬離子部分之間的協(xié)同毒性機(jī)制.此外,在有機(jī)部分發(fā)揮毒性作用的機(jī)理研究中, EBDC類殺菌劑的有機(jī)配體具有與Cu2+、Zn2+螯合的能力,促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的積累,故有機(jī)部分導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)金屬濃度的上升很可能在Maneb細(xì)胞毒性中發(fā)揮作用.金屬在各種生化反應(yīng)中充當(dāng)著催化輔助因子,因此,它們的濃度受到生物系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)節(jié),而這種穩(wěn)態(tài)控制會(huì)被細(xì)胞內(nèi)金屬離子的積累所破壞.在Maneb暴露于細(xì)胞時(shí),還會(huì)導(dǎo)致Mn2+在細(xì)胞內(nèi)的積累,而這些金屬離子的積累會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生.

總之,Maneb的有機(jī)部分可以與一些過(guò)渡金屬離子螯合,促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的積累,但毒性作用有限.Hoffman的結(jié)論表明[20-21],暴露于Maneb時(shí),其有機(jī)部分會(huì)導(dǎo)致HT-29細(xì)胞和Caco2細(xì)胞中Mn、Zn和Cu的顯著積累,細(xì)胞內(nèi)金屬濃度的快速增加改變了金屬穩(wěn)態(tài),產(chǎn)生金屬超載狀態(tài),導(dǎo)致氧化損傷,進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性.Maneb的毒性可能是其有機(jī)部分和金屬離子成分協(xié)同作用產(chǎn)生的.

3.2 Maneb暴露致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制

針對(duì)Maneb暴露對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,本研究使用CCK-8法揭示了其對(duì)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞增殖活性的抑制,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)Maneb抗增殖作用的深層次機(jī)理進(jìn)行探討,即從ROS生成、細(xì)胞凋亡通路的分子層面闡述其致神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制.

ROS是氧化應(yīng)激的指示物,可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子直接或間接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性[32],其穩(wěn)態(tài)濃度的增加會(huì)干擾細(xì)胞代謝、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[33],而線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源[34].有研究提出,Maneb會(huì)誘導(dǎo)還原性谷胱甘肽(GSH)的上調(diào),但在與百草枯共同作用時(shí)并不能增加SH-SY5Y細(xì)胞中ROS的積累[19],低濃度Maneb的暴露并不會(huì)對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞ROS的穩(wěn)態(tài)和抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生影響[10].本研究中,毒性濃度的Maneb可顯著誘導(dǎo)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞中的ROS生成,引起細(xì)胞凋亡和壞死,進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖.如3.1所述,Maneb可能通過(guò)擾亂細(xì)胞內(nèi)的金屬穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致ROS的增多,而ROS的產(chǎn)生可能會(huì)與線粒體的損傷相互促進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞毒性,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡過(guò)程,在生物體正常發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用,而細(xì)胞凋亡失調(diào)或過(guò)度凋亡會(huì)導(dǎo)致多種疾病[35],如多巴胺能神經(jīng)元的過(guò)度凋亡可導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生[36].本研究中,Maneb在20μmol/L的濃度下可顯著導(dǎo)致SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的凋亡.研究表明,細(xì)胞凋亡與線粒體功能異常密切相關(guān),最主要的內(nèi)源性凋亡途徑即是線粒體凋亡途徑[37].而在Maneb的毒性機(jī)制中,線粒體功能障礙是重要因素.Maneb可特異性損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合物III即細(xì)胞色素C還原酶,但其具體的作用機(jī)制尚不清楚[16].最新的研究中,Anderson等[15,17]發(fā)現(xiàn)Maneb可通過(guò)其硫醇結(jié)構(gòu)發(fā)揮毒性作用,Maneb的聚合物構(gòu)型與線粒體蛋白的硫醇結(jié)構(gòu)具有空間鄰近性,這有助于Maneb靶向針對(duì)線粒體關(guān)鍵代謝酶中高度敏感的蛋白質(zhì)硫醇和Fe-S簇直接相互作用,導(dǎo)致線粒體功能失調(diào).總之,Maneb誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用與其對(duì)線粒體功能的損傷密切相關(guān),線粒體凋亡途徑可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑.

3.3 Maneb暴露致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的線粒體凋亡途徑

線粒體凋亡途徑中,在DNA損失、氧化應(yīng)激等各種凋亡信號(hào)的刺激下,位于線粒體外膜上的Bcl-2家族蛋白表達(dá)異常,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax間的相互作用,導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變,從而降低線粒體的膜電位[38].而后處于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C被釋放至細(xì)胞質(zhì)中,與胞質(zhì)中的另一凋亡蛋白Apaf-1結(jié)合而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[39].研究發(fā)現(xiàn),Maneb可能激活線粒體通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40-41].本研究結(jié)果顯示, Maneb可抑制SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且能濃度依賴性上調(diào)Bax、Cyt C和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平.以上結(jié)果提示了Maneb誘導(dǎo)的SH- SY5Y和PC12細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的.但關(guān)于Maneb激活線粒體凋亡途徑中的信號(hào)通路變化和具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究.

總之,Maneb致SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的損傷機(jī)理涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其可能的途徑為:Maneb的有機(jī)部分和金屬離子成分導(dǎo)致了金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+在細(xì)胞內(nèi)的積累,因此引起了SH-SY5Y和PC12細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng),產(chǎn)生了過(guò)多的ROS,加之其對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物III的特異性抑制,導(dǎo)致了線粒體功能障礙,進(jìn)一步激活了線粒體凋亡通路中各分子Bax、Caspase-3表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)降低,同時(shí)使Cyt C從線粒體中釋放至胞漿,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并最終影響細(xì)胞增殖和活性.以上結(jié)果提示Bax和Bcl-2參與的線粒體凋亡途徑,在Maneb誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起重要作用.

4 結(jié)論

4.1 Maneb對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用顯著強(qiáng)于其代謝產(chǎn)物.較低濃度的Maneb的代謝產(chǎn)物暴露對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、ROS水平、細(xì)胞凋亡的影響并不明顯.

4.2 Nabam和MnCl2聯(lián)合暴露時(shí)產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與Maneb單獨(dú)暴露相當(dāng),能顯著抑制多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活性、提高ROS水平、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

4.3 Maneb會(huì)通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡.隨著Maneb暴露濃度的增加,細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)降低,Bax、Cyt C表達(dá)升高, Caspase-3水平上升.

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Neurotoxic effects and mechanisms of Maneb and its metabolites.

LIU Chao-yang1,2,3*, LIU Ze-hua1,2, FANG Yan-yan1,2, YANG Bo-yuan1,2

(1.Research Center for Environment and Health, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；3.Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)., 2022,42(9)：4399～4408

The toxicological effects and mechanisms of Maneb and its metabolites on dopaminergic cells were investigated in depth using SH-SY5Y cells and PC12 cells as experimental samples. The results showed that the organic and metal ion components of Maneb did not have obvious toxic effects when exposed alone, but had synergistic effects when exposed in combination, and the degree of inhibition to cells viability was comparable to that of Maneb at the same concentration level. The reasons for this were related to the generation of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. In addition, the Western Blotting revealed that Maneb reduced the expression of Bcl-2, elevated the level of Bax and Cytochrome C and activated Caspase-3 in a dose-dependent manner, suggesting an important role of the mitochondrial apoptosis pathway in dopaminergic cells apoptosis induced by Maneb.

Maneb；SH-SY5Y cells；PC12 cells；oxidative stress；cell apoptosis

X171.5

A

1000-6923(2022)09-4399-10

2022-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(81822016),國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81571249),中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2020M672420),高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智基地(B21038)

*責(zé)任作者, 副教授, lcy@zuel.edu.cn

劉朝陽(yáng)(1986-),男,湖北洪湖人,副教授,博士,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理與健康、環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.發(fā)表論文近40篇.