梁麗金，趙睿學(xué)，王 上，李 城△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301617；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

結(jié)直腸癌是世界上病死率第四的腫瘤，每年致使近90萬人死亡，而近年來發(fā)病率呈上升趨勢，更是給全球公共衛(wèi)生造成了不小的負(fù)擔(dān)，目前治療方案包括手術(shù)切除、系統(tǒng)治療、局部消融治療、靶向治療和免疫治療等[1-2]。其中，免疫治療在過去的幾十年里一直處于癌癥治療研究的前沿方向，并在結(jié)直腸癌領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)家族由LOX和賴氨酸氧化酶樣蛋白(lysyl oxidase-like,LOXL)1～4組成，它不僅在細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)中起關(guān)鍵作用，還具有其他與纖維化和癌變相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)功能[3]，其中LOXL2是該家族目前研究最多的成員之一。LOXL2最初被認(rèn)為是一種分布在細(xì)胞外的分泌蛋白，近年來因其在癌癥進展中的重要作用受到了重點關(guān)注。研究表明，LOXL2在多種腫瘤中表達異常，并與腫瘤進展及不良預(yù)后有關(guān)[4-5]。尤其在結(jié)直腸癌中，LOXL2與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而敲除LOXL2可使腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力降低[6]。探尋新的腫瘤免疫治療方法是目前研究結(jié)直腸癌的重要方向，因此，本研究基于生物信息學(xué)探討LOXL2在結(jié)直腸癌中的表達模式和預(yù)后價值，并分析LOXL2與免疫浸潤水平的潛在關(guān)系，以期探索免疫治療新靶點和新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本

本實驗中使用的人結(jié)腸癌組織芯片由上海芯超生物科技有限公司提供，組織芯片批號為HColA030PG06。

1.1.2實驗試劑

LOXL2抗體購自英國Abcam公司，兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色

組織芯片脫蠟后，按抗體說明修復(fù)抗原，進行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)乙醇梯度脫水和二甲苯透明后，滴加中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.2Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析

Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)是包含了715個數(shù)據(jù)集和86 733個標(biāo)本的大型癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，可利用其分析LOXL2在結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸組織中的差異表達水平。設(shè)置篩選條件如下：P<0.05，表達水平變化>1.5倍，基因表達差異排序為Top 10%。

1.2.3GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)可基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)快速分析LOXL2在結(jié)直腸癌中的表達水平。檢索LOXL2在結(jié)直腸癌與正常結(jié)腸組織的基因表達譜，條形圖中條形的高度代表LOXL2在結(jié)直腸癌或正常結(jié)腸組織的中位表達水平。

1.2.4Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析

Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)提供了多種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，檢索LOXL2在人正常結(jié)腸組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，分析其表達差異。

1.2.5LOGpc數(shù)據(jù)庫分析

利用LOGpc數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.henu.edu.cn/DatabaseList.jsp)分析LOXL2表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性。進入結(jié)直腸癌模塊，選擇GSE40967(n=579)數(shù)據(jù)集，設(shè)置LOXL2對應(yīng)探針為202998_s_at，以upper 25%為界限劃分高表達組和低表達組，分析總生存期，繪制生存曲線，并對該數(shù)據(jù)集Ⅰ期(n=37)、Ⅱ期(n=269)、Ⅲ期(n=209)及Ⅳ期(n=60)患者的臨床預(yù)后進行分析。

1.2.6TIMER數(shù)據(jù)庫分析

TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)可利用高通量測序數(shù)據(jù)全面、靈活地分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況并可視化。本研究通過基因模塊分析LOXL2與結(jié)直腸癌免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性，并通過相關(guān)模塊分析LOXL2與結(jié)直腸癌中免疫浸潤細(xì)胞標(biāo)志物基因之間的關(guān)系。

1.2.7TISIDB數(shù)據(jù)庫分析

TISIDB數(shù)據(jù)庫(http://cis.hku.hk/TISIDB/)記錄了多種與腫瘤免疫相關(guān)的基因與高通量篩選等數(shù)據(jù)，是腫瘤-免疫系統(tǒng)相互作用的綜合信息存儲庫。本研究使用該數(shù)據(jù)庫的淋巴細(xì)胞版塊分析LOXL2與結(jié)直腸癌免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R4.1.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，應(yīng)用log-rank檢驗生存差異；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LOXL2在結(jié)直腸癌中的表達水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)直腸組織比較，有13項研究顯示LOXL2在結(jié)直腸癌組織中呈高表達水平。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，LOXL2在結(jié)腸癌(中位表達水平：腫瘤標(biāo)本=19.98，正常結(jié)腸組織=15.01)和直腸癌(中位表達水平：腫瘤標(biāo)本=23.51，正常直腸組織=16.66)表達上調(diào)。LOXL2在正常結(jié)腸腺細(xì)胞中呈中等強度表達，在結(jié)腸腺癌組織中為強陽性表達，見表1、圖1。

表1 LOXL2在不同腫瘤中的差異表達情況(n)

2.2 LOXL2表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性

LOXL2高表達組的總生存期明顯低于LOXL2低表達組(P<0.05)。LOXL2高表達與Ⅰ期、Ⅳ期患者總生存期無相關(guān)性(P>0.05)；與Ⅱ期患者總生存期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Ⅲ期患者總生存期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A：結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中LOXL2表達水平比較；B：正常結(jié)腸組織中LOXL2的表達；C：結(jié)腸癌芯片中LOXL2的表達。

A：LOXL2不同表達水平的生存曲線；B：Ⅰ期患者的生存曲線；C：Ⅱ期患者的生存曲線；D：Ⅲ期患者的生存曲線；E：Ⅳ期患者的生存曲線。

2.3 LOXL2與結(jié)直腸癌中免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系

LOXL2與結(jié)腸癌、直腸癌的腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)(結(jié)腸癌:r=—0.336,P<0.001;直腸癌:r=—0.269,P<0.001)。LOXL2與結(jié)直腸癌中CD8+T細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.194,P<0.001;直腸癌:r=0.345,P<0.001)、樹突狀細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.601,P<0.001;直腸癌:r=0.631,P<0.001)、巨噬細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.469,P<0.001;直腸癌:r=0.401,P<0.001)和嗜中性粒細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.521,P<0.001;直腸癌:r=0.583,P<0.001)的浸潤水平均呈正相關(guān)。使用TISIDB數(shù)據(jù)庫驗證LOXL2與上述4種免疫細(xì)胞的關(guān)系，LOXL2與激活的樹突狀細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.307,P<0.001;直腸癌:r=0.400,P<0.001)和嗜中性粒細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.340,P<0.001;直腸癌:r=0.318,P<0.001)的浸潤水平呈正相關(guān)，但與巨噬細(xì)胞(結(jié)腸癌:r=0.527,P<0.001;直腸癌:r=0.466,P<0.001)關(guān)系最密切，見圖3。

A：LOXL2與結(jié)腸癌中6種免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性；B：LOXL2與直腸癌中6種免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性；C：LOXL2與結(jié)腸癌中特定類型免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性；D：LOXL2與直腸癌中特定類型免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。

2.4 LOXL2與結(jié)直腸癌中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性

結(jié)直腸癌中LOXL2與M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)5、環(huán)加氧酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription，STAT)1相關(guān)，與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IRF4、Toll-樣受體8 (Toll-like receptors 8，TLR8)相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表1 LOXL2與結(jié)直腸癌中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的關(guān)系

續(xù)表1 LOXL2與結(jié)直腸癌中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的關(guān)系

3 討 論

LOXL2對維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性具有重要的生理意義，并通過細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤進展中起著極其關(guān)鍵的影響作用[7-8]。此外，LOXL2還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[9-10]、影響腫瘤血管生成等[11-13]。值得注意的是，LOXL2與腫瘤免疫也有著密切的關(guān)系。一方面，隨著機體對腫瘤免疫應(yīng)答的增強，可觀察到LOXL2表達下調(diào)[14]；另一方面，抑制LOXL2不僅可使腫瘤膠原沉積減少，還可提高T細(xì)胞浸潤水平[15]，有助于開發(fā)新的免疫治療策略。目前LOXL2在結(jié)直腸癌領(lǐng)域的相關(guān)研究較少，而結(jié)直腸癌作為全球重點關(guān)注的健康問題，如何早期發(fā)現(xiàn)和有效治療一直是研究重點[1]。隨著對結(jié)直腸癌病理生理學(xué)認(rèn)識的逐漸深入，科學(xué)家們相應(yīng)提出了不少可供選擇的治療方案。近年來更有研究提出，結(jié)直腸癌是腫瘤免疫治療的典范模型[16]。

因此，本研究提出探討LOXL2在結(jié)直腸癌中的表達水平及臨床意義，并結(jié)合免疫浸潤初步探究其機制。(1)利用多種公共數(shù)據(jù)庫及免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)LOXL2在腫瘤組織和正常結(jié)直腸組織中的表達存在明顯差異，在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)。在預(yù)后價值方面，LOXL2高表達與結(jié)直腸癌患者較差的總生存期相關(guān)，且或許可用于對處于Ⅱ期～Ⅲ期的患者進行臨床分級，并作為不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。(2)用TIMER和TISIDB兩個數(shù)據(jù)庫分析LOXL2與腫瘤免疫浸潤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LOXL2與結(jié)直腸癌中樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)。其中，本研究結(jié)果顯示，LOXL2與巨噬細(xì)胞的浸潤水平及其細(xì)胞標(biāo)志物關(guān)系最密切。巨噬細(xì)胞是慢性炎癥的重要組成部分，參與了包含腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病[17]。巨噬細(xì)胞可分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞兩大類，M1型巨噬細(xì)胞可吞噬腫瘤細(xì)胞，而M2型巨噬細(xì)胞則可促進腫瘤生長和侵襲。不少研究表明，巨噬細(xì)胞分化及表型改變可促進腫瘤進展[18-19]，而浸潤在腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞一旦轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，即可募集并表達細(xì)胞因子和趨化因子，進而成為腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素[20]。尤其在結(jié)直腸癌中，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量比M1型多，不僅抑制抗腫瘤免疫[21]，其衍生的外泌體還可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移[22]，提示M2型巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸癌密切相關(guān)?；诖?，有人提出了靶向巨噬細(xì)胞用于腫瘤免疫治療的策略[23]。而本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中LOXL2與巨噬細(xì)胞之間存在很強的關(guān)系，這不僅進一步證實LOXL2對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展有重要作用，還提示LOXL2可能參與結(jié)直腸癌中的巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述，LOXL2在結(jié)直腸癌中的高表達與患者預(yù)后不良相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，LOXL2表達可能有助于巨噬細(xì)胞等腫瘤免疫浸潤細(xì)胞的調(diào)節(jié)。盡管其具體作用機制還需深入研究，但LOXL2在結(jié)直腸癌領(lǐng)域扮演的重要角色是不可忽視的，或許還可作為免疫治療的潛在靶點。