王 瑞，馬騰達(dá)，屈才浩，李玉民△

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，蘭州 730030；2.甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，蘭州 730030)

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球最新癌癥統(tǒng)計顯示：新發(fā)病例超過100萬,估計死亡病例76.9萬，已經(jīng)成為第五大最常見的癌癥和第四大癌癥死亡原因[1]。目前，全球43.9%的胃癌新發(fā)病例和48.6%的胃癌致死病例發(fā)生在中國，對我國的公共衛(wèi)生領(lǐng)域構(gòu)成了極大的挑戰(zhàn)[2]。盡管目前以手術(shù)、放化療、靶向治療和免疫治療的聯(lián)合治療改善了胃癌患者的生存和預(yù)后，但進(jìn)展期胃癌患者接受手術(shù)后的5年生存率仍不理想[3-4]。因此，尋找胃癌相關(guān)的診斷及預(yù)后標(biāo)志物對于改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

GLIS3基因位于染色體9p24.2上，共有11個外顯子，編碼930個氨基酸，它是GLI樣鋅指蛋白家族的成員之一，其異常表達(dá)與一些病理狀態(tài)有關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、肋骨骨折、甲狀腺功能減退癥、胰腺功能不全和糖尿病[5]。近年來，隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)GLIS3的異常表達(dá)與癌癥有關(guān)，如上皮瘤[6]、乳腺癌[7]等，但GLIS3在胃癌中的作用仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，探討GLIS3在胃癌中的表達(dá)及其與免疫浸潤、預(yù)后的意義，并預(yù)測調(diào)控GLIS3表達(dá)的微RNA(microRNA,miRNA)和GLIS3在胃癌可能參與的生物學(xué)功能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.tcga.org)下載胃癌mRNA-seq數(shù)據(jù)、miRNA-seq數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，其中包括375個腫瘤組織和32個正常組織。使用R及perl軟件整理合并數(shù)據(jù)文件。排除了生存時間缺失和臨床信息不完整的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1GLIS3在腫瘤中的表達(dá)差異分析

利用TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)分析GLIS3在不同腫瘤中的表達(dá)水平。使用R軟件提取GLIS3在胃癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析GLIS3在胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)差異,并分析其在26例配對胃癌及癌旁組織標(biāo)本的表達(dá)水平，使用GEPIA在線工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)進(jìn)行表達(dá)差異驗證。用受試者工作特征(ROC)曲線評價GLIS3在胃癌中的診斷性能。

1.2.2GLIS3表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

根據(jù)下載整理的患者臨床病理信息，匹配GLIS3表達(dá)水平，研究GLIS3與年齡、性別、組織學(xué)分級、TNM分期等臨床相關(guān)性。

1.2.3GLIS3表達(dá)水平與胃癌患者的生存分析

以GLIS3表達(dá)水平中位數(shù)為截斷值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組間的生存差異，并用“survival”包繪制生存曲線。同時使用GEPIA進(jìn)一步驗證GLIS3在胃癌患者中的生存關(guān)系。采用單因素和多因素Cox回歸分析判斷GLIS3在胃癌中的預(yù)后價值。

1.2.4預(yù)測胃癌中調(diào)控GLIS3異常表達(dá)的miRNA

運用miRWALK(3.0)、TargetScan v7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測調(diào)控GLIS3的miRNA,并與TCGA數(shù)據(jù)庫篩選得到的差異表達(dá)的miRNA取交集獲得共同的miRNA。進(jìn)一步通過線性回歸分析，確定胃癌中調(diào)控GLIS3異常表達(dá)的miRNA。

1.2.5基因富集分析

采用GSEA(版本4.0.3)以分子特征數(shù)據(jù)庫中c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集作為功能基因集，對GLIS3高表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因富集分析。P<0.05和錯誤發(fā)生率(false discovery rate,FDR)<0.25的基因集作為明顯富集的基因集。

1.2.6免疫浸潤分析

運用TIMER數(shù)據(jù)庫分析GLIS3表達(dá)水平與胃癌免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，包括CD4+T、CD8+T和巨噬細(xì)胞等。另外，將375例腫瘤標(biāo)本以GLIS3表達(dá)水平中位數(shù)為界分為高、低表達(dá)兩組。使用CIBERSORT算法(http：//cibersort.stanford.edu/)評估兩組中免疫細(xì)胞占比，繪制22種免疫細(xì)胞在GLIS3高低表達(dá)組占比的小提琴圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗生存差異；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GLIS3在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)差異

與癌旁組織比較，GLIS3在膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等腫瘤中高表達(dá)，見圖1。TCGA數(shù)據(jù)庫中，GLIS3在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)，26例配對的胃癌組織中GLIS3也高表達(dá)。同樣，GEPIA數(shù)據(jù)庫的驗證結(jié)果顯示，GLIS3在胃癌組織中的表達(dá)也高于癌旁組織(P<0.05)。另外，通過ROC曲線分析顯示，GLIS3對胃癌具有明顯的診斷價值，曲線下面積(AUC)=0.763(P<0.05)，見圖2。

圖1 TIMER數(shù)據(jù)庫中GLIS3在不同腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)

A:TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3胃癌及癌旁組織中的表達(dá)；B:TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3在配對胃癌及癌旁組織中的表達(dá)；C：GEPIA數(shù)據(jù)庫中GLIS3在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)；D：GLIS3診斷胃癌的ROC曲線；a：P<0.05。

2.2 GLIS3表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

GLIS3表達(dá)與患者腫瘤組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期無關(guān)，見圖3。

2.3 GLIS3表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫得到的生存曲線表明，GLIS3的差異表達(dá)明顯影響胃癌患者生存預(yù)后，與低表達(dá)組比較，GLIS3高表達(dá)組總體生存期明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GEPIA在線數(shù)據(jù)庫生存曲線同樣表明，GLIS3高表達(dá)組生存率明顯低于低表達(dá)組(P<0.05)，見圖4。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，GLIS3表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素，見表1。

圖3 GLIS3表達(dá)與胃癌患者臨床病理資料的相關(guān)性

表1 影響胃癌患者預(yù)后的Cox單因素及多因素回歸分析

2.4 調(diào)控GLIS3異常表達(dá)的miRNA

miR-204-5p是調(diào)控GLIS3表達(dá)的潛在miRNA。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-204-5p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)。且在配對的胃癌組織中也明顯下調(diào)，通過相關(guān)性分析顯示，miR-204-5p與GLIS3 mRNA表達(dá)情況呈明顯負(fù)相關(guān)(r=—0.17,P<0.001)，見圖5。

2.5 基因富集分析預(yù)測GLIS3的功能

GSEA富集分析共篩選出與GLIS3高表達(dá)相關(guān)的12個P<0.05且FDR<0.25的基因集，選取7個有意義的信號通路，發(fā)現(xiàn)GLIS3高表達(dá)主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、鈣、黏著斑、縫隙連接、腫瘤、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、緊密連接這些信號通路，見表2、圖6。

表2 GLIS3在胃癌中的基因富集分析

續(xù)表2 GLIS3在胃癌中的基因富集分析

A：TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的生存曲線；B：GEPIA數(shù)據(jù)庫中GLIS3與胃癌患者預(yù)后的生存曲線。

A：miR-204-5p在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平；B:miR-204-5p在配對胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平；C：miR-204-5p表達(dá)與GLIS3表達(dá)之間的相關(guān)性;a:P<0.05。

2.6 GLIS3表達(dá)與胃癌組織中免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系

使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，GLIS3表達(dá)與胃癌組織中CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞均呈正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.194、0.314、0.147、0.174。以GLIS3表達(dá)的中位值為界，將375個腫瘤標(biāo)本分為高低表達(dá)兩組，使用CIBESORT算法分析22種免疫細(xì)胞表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示記憶B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(M2)、靜止樹突狀細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞是受GLIS3表達(dá)影響的主要細(xì)胞，其中高表達(dá)組的巨噬細(xì)胞(M2)、靜止樹突狀細(xì)胞增加(P<0.05)，而活化的樹突狀細(xì)胞減少(P<0.05)，見圖7。

圖6 GLIS3在胃癌中的相關(guān)通路

A:GLIS3表達(dá)與免疫浸潤水平之間的相關(guān)性；B:腫瘤標(biāo)本中GLIS3高表達(dá)和低表達(dá)組中22種免疫細(xì)胞小提琴圖。

3 討 論

胃癌的發(fā)生是癌基因、抑癌基因、細(xì)胞黏附因子、DNA修復(fù)基因、遺傳不穩(wěn)定性及端粒酶活化等多種因素共同作用的結(jié)果，而轉(zhuǎn)錄因子在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。GLIS3基因中的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)和C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能中起到重要作用[8]。GLIS3的過表達(dá)已在多種腫瘤細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)，包括甲狀腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]和黑色素瘤[11]。此外。RAMI等[7]檢測了15例新鮮乳腺癌組織和癌旁組織GLIS3基因mRNA的含量，發(fā)現(xiàn)癌組織中GLIS3表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，同時使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體-2(HER-2)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中的GLIS3同樣高表達(dá)。因此，GLIS3有助于三陰性乳腺癌的診斷和預(yù)后，或許還可作為這些患者治療的靶點。本研究首先進(jìn)行GLIS3基因的泛癌表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其在包括胃癌的多種腫瘤中高表達(dá)，再利用TCGA數(shù)據(jù)庫證實了GLIS3在胃癌組織中明顯上調(diào)，且對胃癌具有一定的診斷價值，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GLIS3高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，COX回歸模型再次驗證：GLIS3表達(dá)是胃癌患者的獨立危險因素，可作為胃癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

為了進(jìn)一步研究胃癌中GLIS3基因異常表達(dá)的潛在機(jī)制，本研究使用多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測其上游的miRNAs。miRNAs作為一類內(nèi)源性非編碼短RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要作用，其作為腫瘤致癌或抑癌因子參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過程[12]。既往研究表明，miR-204-5p作為腫瘤抑制因子在結(jié)腸癌[13]、肺癌[14]、前列腺癌[15]、胃癌[16]等癌癥中明顯下調(diào)。YANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p在胃癌組織中明顯下調(diào)，且通過調(diào)節(jié)HER-2來抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤功能，這可能是胃癌的一個潛在治療靶點。ZHANG等[18]研究表明miR-204-5p通過靶向CXCR4和CXCL12來調(diào)控胃癌的侵襲和遷移，且miR-204-5p低表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-204-5p在胃癌組織表達(dá)明顯下調(diào)，這與此前的研究報道結(jié)論一致，且miR-204-5p與GLIS3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，推測GLIS3在胃癌中的異常表達(dá)，可能是由于miR-204-5p表達(dá)下調(diào)造成的，但仍需進(jìn)一步研究證實。

本研究使用GSEA分析了GLIS3可能參與的生物學(xué)通路，高表達(dá)標(biāo)本主要富集到ECM受體相互作用、鈣、黏著斑、縫隙連接、腫瘤、MAPK、緊密連接等，其中ECM受體相互作用是富集分?jǐn)?shù)最高的信號途徑，它在腫瘤的脫落、黏附、降解和增生過程中發(fā)揮著重要作用[19]，并參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[20]。此外，在侵襲性黑色素瘤中，GLIS3表達(dá)水平升高與E-鈣黏蛋白表達(dá)水平降低有關(guān)，且通過siRNA下調(diào)GLIS3的表達(dá)后可抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。本研究表明GLIS3的表達(dá)與胃癌的分化程度相關(guān)，因此，推測GLIS3的表達(dá)增加可能會促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，有研究證實可能與刺激了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)[21]，而EMT是腫瘤最常見的侵襲和轉(zhuǎn)移起始原因[22]。因此，GLIS3可能是通過參與細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程影響患者的生存，進(jìn)一步證實GLIS3可以作為預(yù)測患者腫瘤轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。

此外，TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示GLIS3的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞具有相關(guān)性。CIBESORT算法結(jié)果表明GLIS3高表達(dá)組中，巨噬細(xì)胞(M2)、靜止樹突狀細(xì)胞增加，這與TIMER數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)論一致。既往研究表明巨噬細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且巨噬細(xì)胞浸潤程度越高，胃癌患者預(yù)后越差[23]。這可能提示GLIS3的過表達(dá)有效促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)和浸潤。

綜上所述，GLIS3有望成為胃癌潛在的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物。同時，本研究還探討了GLIS3異常表達(dá)的潛在調(diào)控機(jī)制、可能參與的生物學(xué)功能和免疫浸潤之間的關(guān)系，為后續(xù)深入研究GLIS3基因與胃癌的關(guān)系提供了理論支持。